用于基因組文庫中的真核DNA的部分酶切（預反應）實驗

限制性內切核酸酶 基因組 DNA λ 噬菌體 DNA 質粒寡聚體

蔗糖凝膠上樣緩沖液 Tris-Cl

瓊脂糖凝膠 毛細管 透析袋 水浴 寬口移液尖頭

一、材料

1. 緩沖液和溶液

蔗糖凝膠上樣緩沖液

Tris-Cl (10 mmol/L, pH 8.0)

2. 酶和緩沖液

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠（0.6%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠

瓊脂糖凝膠，用于脈沖場凝膠電泳

4. 核酸和寡核苷酸

基因組 DNA，高分子質量

λ 噬菌體 DNA 和質粒寡聚體

5. 專用設備

毛細管，封口

透析袋，煮過

預置于 70℃ 的水浴

寬口移液尖頭

二、方法

1. 利用將被用于制備克隆片段的同一份基因組 DNA 建立預實驗。

(1) 將 30 μg 高分子質量真核 DNA 用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 稀釋至 900 μl，加入 100 μl 適當的 10X 限制酶緩沖液。

(2) 用一個封口的玻璃毛細管將溶液輕輕混勻，確保高分子質量 DNA 已完全均勻地分布于限制酶緩沖液中。

(3) 混勻后，將稀釋 DNA 于室溫放置 1 h，使殘余的 DNA 聚集塊能徹底地解散。

2. 用 1 至 10 標記微量離心管。用一寬口的玻璃毛細管或一次性塑料移液器尖頭將 60 μl DNA 溶液轉移至一微量離心管中（第 1 管 )。轉移 30 μl DNA 溶液至其他標記的 9 個微量離心管中。冰浴放置。

3. 加 2 單位適當的限制酶至第 1 管中。

4. 用一新鮮的移液尖頭將第 1 管中 30 μl 反應液轉移至系列離心管的第 2 管內。如前所述混勻，繼續轉移至下一個離心管中。在第 10 管中不加任何東西（無酶對照），同時從第 9 管中取出 30 μl 舍棄。

5. 37℃ 溫育 1 h。

6. 70℃ 加熱 15 min，使酶失活。

7. 將反應冷卻至室溫，加入適當量的蔗糖凝膠上樣緩沖液。

8. 用寬口塑料移液尖頭或一次性玻璃毛細管將溶液轉移至 0.6% 瓊脂糖凝膠的點樣孔內，更好的是轉移至脈沖場凝晈電泳的上樣槽中，隨后進行電泳。

9. 將消化的真核 DNA 大小與含 λ 噬菌體和質粒寡聚體的 DNA 標準進行比較。鑒別能獲得大量理想大小基因組 DNA 的部分酶切條件。