實驗方法原理 通過限制酶部分酶切可將高分子質量 DNA 片段化。在預實驗中，建立了適宜的部分酶切條件。對于將用于克隆的基因組 DNA 來說，預實驗的結果確定了對其進行制備的三個大規模反應的條件，這將在本方案敘述。
實驗材料 限制性內切核酸酶基因組 DNAλ 噬菌體 DNA質粒寡聚體
試劑、試劑盒 乙酸銨乙醇正丁醇酚：氯仿乙酸鈉蔗糖凝膠上樣緩沖液TETris-Cl
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠Beckman SW28 或相當型號透析袋梯度分級分離設備蔗糖梯度
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙酸銨（10 mol/L）
乙醇
正丁醇
酚：氯仿（1:1, V/V）
乙酸鈉（3 moI/L, pH 5.2)
蔗糖凝膠上樣緩沖液
TE ( pH 8.0)
Tris-Cl (10 mmol/L, pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠（0.6%），用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
瓊脂糖凝膠，用于脈沖場凝膠電泳
4. 核酸和寡核苷酸
基因組 DNA, 高分子質量
λ 噬菌體 DNA 和質粒寡聚體
5. 離心機和轉子
Beckman SW28 或相當型號
6. 專用設備
透析袋，煮過
梯度分級分離設備（gradient fractionating device）（可供選擇）
蔗糖梯度（用含 1 mol/L NaCl、20 mol/LTris-Cl（pH 8.0）、5 mol/L EDTA（pH 8.0）的緩沖液制備兩種蔗糖溶液，一種含 10%（m/V）的蔗糖，另一種含 40%（m/V）的蔗糖。經 0.22 μm 硝酸纖維素膜的過濾進行無菌處理。）
預置于 68℃ 的水浴
二、方法
梯度的制備
1. 在清亮的超速離心管中制備一個或多個 38 ml (10%~40%, m/V）蔗糖梯度，于 4℃ 靜止 1~2 h 直到被使用（步驟 5)。
2. 建立一系列消化反應，每個含有 100 μg 的高分子質量 DNA。
(1) 用限制酶的三種不同濃度，而這三種濃度剛好跨過預實驗中所確定的最佳濃度。
(2) 將各反應溫育適當的時間。
(3) 用凝膠電泳分析部分酶切 DNA, 確證整個消化反應按預期的進行。得到結果后，將剩余樣品置于 0℃。
3. 用酚: 氯仿輕輕地抽提消化 DNA 兩次。
4. 通過標準的乙醇沉淀回收 DNA, 并溶于 200 μl TE ( pH 8.0) 中。
通過梯度按分子質量大小分級分離 DNA
5. 將 DNA 樣品于 68℃ 加熱 10 min, 再冷卻至 20℃，然后輕輕地加至梯度的頂層。將梯度于 20℃、83000 g ( 25000 r/min 于 Beckman SW28 轉子中）離心 22 h。
離心在室溫進行而不是 4℃，是為了抑制分子內和分子間黏性末端的復性。
6. 用 21 號注射針頭或梯度分級分離設備刺穿離心管底，收集 350 μl 樣品。
7. 從收集的樣品中每隔一管取 10 μl，與 10 μl 水和 5 μl 蔗糖凝膠上樣緩沖液混勻。
0.6% 瓊脂糖凝膠電泳分析所有樣品中 DNA 的大小，并用質粒 DNA 寡聚體或其他高分子質量標準 DNA 作標志物。標志物中的蔗糖和鹽濃度應與樣品中的一致。
8. 電泳后，將含有理想大小 DNA 片段（如用于黏粒文庫構建的為 35~45 kb, 用于 λ 噬菌體載體文庫構建的為 20~25 kb) 的樣品合并。
9. 將合并的樣品置 2 L TE ( pH 8.0) 中，于 4℃ 透析 12~16 h, 4~6 h 后更換一次緩沖液。
在透析袋中留出足夠空間，因透析過程中樣品的體積將增加 2~3 倍。
另外，如果合并樣品的體積足夠小，可不必進行預透析，而用 TE ( pH 8.0) 進行稀釋使樣品中蔗糖濃度降低到 10% 或更低，然后直接用乙醇進行 DNA 沉淀。
10. 用等體積的正丁醇抽提透析樣品數次，使樣品體積降低至 1 ml 左右。
11. 在 2 mol/L 乙酸銨（來源于 10 mol/L 的母液）存在的情況下，于室溫用乙醇沉淀 DNA。
12. 離心、回收 DNA, 并溶解于 TE ( pH 8.0) 中，濃度為 300~500 μg/ml。取一份 DNA ( 0.5 μg) 進行分析，用常規的 0.6% 瓊脂糖凝膠電泳或脈沖場電泳確證消化產物的大小分布是正確的。將 DNA 保存于 4℃。
13. 為了建立基因組 DNA 文庫，將分級分離 DNA 與 λ 噬菌體載體臂相連。