用于基因組測序及足跡分析的連接介導PCR實驗3

懸浮培養細胞

PBS裂解液100%硫酸二甲酯（DMS)100%乙醇室溫

50 mL螺口聚丙烯管（如Coming公司產品）臺式離心機

1) 在50 mL螺口聚丙烯管中分別準備3份49 mL PBS,用前置于冰上預冷至少30 min。配制裂解液并且在15 mL螺口聚丙烯管中準備3份2.7 mL裂解液。

2) 將2份含有0.5×10⁸?1×l0⁸細胞的培養液轉移至50 mL聚丙烯管中，在臺式離心 機上室溫500 g (在IEC Centra-7R離心機上為1500r/min)離心5 min,吸出并棄上清。留下足以將細胞重懸至1 mL終體積的培養液，用手指彈擊管底部，或用移液器輕輕地上下抽吸以重懸細胞。

3) 對于對照（未處理的）懸浮細胞：將1 mL重懸細胞加入1份49 mL冰冷的PBS溶液中，輕輕顛倒以充分混合，于4℃ 500 g離心5 min，然后進行步驟8。

4) 對于DMS處理懸浮細胞：將1 mL重懸細胞轉移到L 5 mL微量離心管中，然后在通風櫥中的37℃水浴中保溫。

5) 將10μL室溫100% DMS加入到90μL100%乙醇制備10%的DMS溶液。在渦旋混 合器上振蕩25 s以充分混勻，稍加離心，收集液滴。10%的DMS用乙醇配制是由于該濃度的DMS不溶于水。

6) 加入10μL 10%的DMS溶液于保溫的細胞中，輕輕顛倒以混勻，37℃溫育1 min。 立即將細胞加入到冰冷的1份49 mL PBS溶液中，輕輕顛倒以混勻，于4℃500 g離心 5 min。此處所列出的DMS的用量及溫育時間，適用于作為預備試驗的出發條件，為得到最佳的DMS足跡，可能有必要對它們進行修正。

7) 吸出并棄上清。然后從第3份冰冷的PBS溶液中取1?5 mL將細胞迅速重懸，立即加入冰冷的PBS到50 mL管中，輕輕顛倒以混合。在4℃ 500 g離心5 min。

8) 對于對照細胞和處理細胞：吸出并棄上清。細胞重懸于300μL冰冷的PBS，然后轉移到獨立的每份2.7 mL的裂解液中，輕輕顛倒以混合。繼續DNA提取步驟，并進行對照DNA的DMS處理及哌啶斷裂