用于檢測和定量分析極性細胞代謝物的一種新穎...（一）

用于檢測和定量分析極性細胞代謝物的一種新穎的HILIC LC-MS方法

Henry Shion¹、John Shockcor¹、Evan Bernier²、Stephen Mcdonald²、Kirsten Hartil³、Bhavapriya Vaitheesvaran³、Haitao Lu³、Gustavo Palacios³、Inwin J. Kurland³、Alan L. Millar¹

¹沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德；²沃特世公司，美國馬薩諸塞州貝弗利；³猶太大學阿爾伯特?愛因斯坦醫學院，美國紐約市布朗克斯區

引言

復雜生物樣品通常包含大量可反映有機體代謝狀態的內源性代謝物。特別是骨骼肌可根據其是快收縮肌（白色肌肉，糖酵解型）還是慢收縮肌（紅色肌肉，氧化型）而表現出特征性的代謝組“指紋圖譜”。例如，紅色肌肉應顯示一種富含線粒體代謝物（如三羧酸循環）的代謝組指紋圖譜；而白色肌肉應顯示富含糖酵解代謝物的代謝組指紋圖譜，其線粒體代謝物的濃度大大低于紅色肌肉。雖然很多這類代謝物可具有較強的極性，但這些樣本通常使用反相液相色譜-質譜（RP-LC-MS）進行分析，由此而來的多是較差的保留。在本研究中，我們開發了一種用于檢測和定量強極性細胞代謝物的新穎LC-MS方法。本研究采用了基于亞2微米顆粒BEH酰胺柱的親水作用液相色譜（HILIC），并聯用了雜化四極桿飛行時間質譜儀和三重四極桿質譜。

方法

這些試驗借助聯用了沃特世Synapt^TM HDMS^TM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一臺UPLC系統而進行：

液相色譜條件（1）：使用堿性流動相

液相色譜系統：沃特世ACQUITY UPLC^?系統

－    色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7μm

－    柱溫：45℃

－    流速：500μL／分鐘

－    堿性流動相A：乙腈／水，95/5（v/v），10mM醋酸銨，pH=9.0

－    堿性流動相B：乙腈／水，50/50（v/v），10mM醋酸銨，pH=9.0

－    梯度（采用堿性流動相進行分離時）：線性梯度，先用2% B - 85% B洗脫8分鐘，然后在98% B的水平下保持2分鐘，接著返回到2% B的水平進行再平衡（5分鐘）

－    進樣量：5-20μL

液相色譜條件（2）：使用酸性流動相

液相色譜系統：沃特世^?ACQUITY UPLC^?系統

－    色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7μm

－    柱溫：40℃

－    流速：600μL／分鐘

－    酸性流動相A：乙腈／水，95/5（v/v），10mM醋酸銨，pH=3.0

－    酸性流動相B：水，10mM醋酸銨，pH=3.0

－    梯度：先用5% B - 30% B洗脫5分鐘，在第5.5min時升至60% B并保持7分鐘，接著返回到5% B的水平進行再平衡（5分鐘）

－    進樣量：20μL滿定量環