用于酶聯免疫測定（ELISA）酶的色原底物

辣根過氧化物酶的色原底物

HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2，2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](雜環吖嗪)、四甲基聯苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦聯底物對等。上述色原底物受HRP作用主要有兩種形式的反應：①氧化還原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一個氨基芳香劑與另一個芳香基化合物的氧化耦聯，如4—氨基安替比林：苯酚等。

(一)氧化還原色原底物

OPD被認為是HRP最為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫(H202)

氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右時，DAB在波長450nm處有廣范圍的最大吸收，當pH值降為1．0時，最大吸收波長移動至492nm，同時摩爾消光系數變大，顯色加深(圖4—2)。因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。實際工作中，用強酸尤其是鹽酸終止反應后，顯色并不穩定，常隨時間增長而顏色加深，這是由于反應后剩余的過氧化氫繼續氧化OPD而產生非酶催化的DAB的結果。有人在強酸反應終止液中加入還原劑如亞硫酸鈉，因還原劑可迅速完全地將剩余的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化，結果顯色穩定，數十小時內不變，而且無需避光。OPD的缺點是其對機體具有致突變作用。由于OPD的不穩定性，現在的商品試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應，臨用時再溶解于相應的緩沖液。

在ELISA測定時，OPD色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：在0．1mol／L枸櫞酸鹽緩沖液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②終止液：2 mol／L硫酸(含0．1 mol／L亞硫酸鈉)；③測定波長：492nm。

TMB是一種優于OPD的新型HRP色原底物。其氧化產物聯苯醌在波長450nm處有最大消光系數，如果HRP量少，過氧化氫溶液和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為黃色的聯苯醌(圖4—3)。使用硫酸作為終止劑可使產物穩定90min，但隨后本底顯色就不斷加深，國內有人認為使用1％SDS作為終止劑，可使鮮藍色24h內保持不變，陰陽性對比十分明顯，但在我們實驗室發現1％SDS對上述顯色有較強的褪色作用，目前仍以硫酸作為終止劑較為理想。ELISA中，底物反應顯色后，常選擇其具最大吸收的波長450nm比色測定結果。而’Maderacher和Berger等為提高以TMB作底物的ELISA測定的敏感性，選擇顯色呈指數加深時的波長405nm比色測定。他們首先測定一系列已知濃度的標準品在450nm和405nm的值，證實A450nm／A405nm之比為3．2，然后在使用波長405nm測定含低濃度待測物的標本得到的OD值再乘以常數3．2，即為待測標本在波長450nm處的真值。該種雙波長測定方法可使ELISA測定范圍提高3倍。TMB的顯色反應雖與OPD一樣同屬氧化還原反應，但前者的反應是可逆的，如終止液中存在還原劑(維生素C及亞硫酸鈉、SDS等)，則可反應顯色迅速消退。TMB雖然溶解度相對較低，但由于其高檢測敏感性及無致突變作用，現已基本上取代了OPD而成為HRP最為常的色原底物。

在商品ELISA試劑盒尤其是國內的產品中，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液，一種為TMB溶液，鑒于過氧化氫、TMB在溶液中相對不穩定的特點，因此，我們在使用ELISA試劑盒時，如發現底物A和(或)B出現顏色，或二者各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質或已受污染，必須廢棄。

在ELISA測定時，TMB色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0．1 mol／L的濃度溶于二甲亞砜，然后，再將其以1 mmol／L和H202以3．0 mmol／L的濃度溶于0．2mol／L醋酸鈉／枸櫞酸緩沖液(pH4．0)，即可應用。②終止液：2 mol／L硫酸。③測定波長：450nm。

ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨鹽轉變為易發生歧化的陽離子根(圖4—4)。陽離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產物相比更適于可見光測定(測定波長入＝414nm)。上述顯色也不穩定，10 mmol／L疊氮鈉是較為理想的終止劑，可使顯色穩定數十小時，且可減少陽離子根的歧化。另有人報道用1．25％NaF終止反應效果較好。

ABTS在目前國內的ELISA試劑盒中基本上沒有應用，但在國外ELISA試劑盒偶見有應用。

在ELISA測定時，ABTS色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol／L和H202以2．5 mmo!／L的濃度溶于0．1 mol／L醋酸鹽緩沖液(pH 4．2)，即可應用；②終止液：10 mmol／L疊氮鈉；③測定波長；414nm或405nm。

除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine(ODA)，5—氨基水楊酸(5—AS)以及dicarboxindine等。

(二)氧化耦聯色原底物對

HRP的氧化耦聯色原底物對主要有4—氨基安替比林：苯酚耦聯底物對(Trinder試劑)和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙(MBTH)；二甲基苯胺(DMA)耦聯底物對(Ngo—Lenhoff試劑)等。

在H202存在下，4—氨基安替比林和苯酚經HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有最大吸收(圖4—5)。

該耦聯色原底物對用于固相ELISA時，敏感性一般較低，反應見光不穩定，而且苯酚易發生多聚化，缺乏適當的反應終止劑。因此，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標的酶法檢測應用。1989年日本學者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗，可用甲醛終止反應。但這種方法僅停留在實驗室階段，其后也未見有其他實驗室的應用報道，可能還有其固有的缺陷。

4—氨基安替比林：苯酚耦聯底物對色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基安替比林以2 mmol／L，苯酚以25 mmol／L和H202以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)，即可應用；②終止液：未見報道；③測定波長：492nm。

MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺(indamine)，最大吸收波長為590nm，見光不穩定。用鹽酸或硫酸終止反應后，pH應為3．0左右，pH值的降低使顯色從紫藍色轉變為清晰的藍色，最大吸收波長從590nm變為595nm，然而pH值的進一步降低，將導致光吸收消失。

MBTH：DMA耦聯對在固相ELISA測定幾乎沒有應用。