用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法（一）

一種用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法
來源：方統科技
----------------------------------------------------------------------------------

摘要： 本文介紹了一種用于PCR的植物基因組DNA的快速制備方法。該方法只需將少量(4～6mg)植物葉片、適量(200μl) TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細胞研磨器中振動5min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡單快速、成本低、擴增效果好等優點，特別適合于大量樣品的基因型檢測。 

王蘭^{1, 2}   龍云銘²  劉耀光²
1 華南農業大學農學院，廣東省植物分子育種重點實驗室
2 華南農業大學生命科學學院，廣東省教育廳植物功能基因組與生物技術重點實驗室

摘要：本文介紹了一種用于PCR的植物基因組DNA的快速制備方法。該方法只需將少量(4～6mg)植物葉片、適量(200μl) TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細胞研磨器中振動5min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡單快速、成本低、擴增效果好等優點，特別適合于大量樣品的基因型檢測。

關鍵詞: 水稻，DNA制備，PCR

隨著生物技術的迅速發展，PCR技術已廣泛應用于遺傳育種的各個領域，如種子純度鑒定、親緣關系的分析、分子標記輔助育種、基因定位以及轉基因植株檢測等。在大規模的基于PCR的基因型檢測作業中，高效快速的模板DNA制備顯得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸鈉(SDS)和氯仿從生物細胞中分離提取DNA樣品的經典方法以來,人們一直致力于對DNA抽提方法的探討，并先后報道了一些關于DNA抽提的方法（Dellaporta et al., 1983; 宣樸等，1998；汪秀峰等，2002；周淑芬等，2004）。但這些方法仍然煩瑣費時。本研究對作為PCR模板的植物基因組DNA制備方法作了簡化,只需將少量葉片、適量TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細胞研磨器中振蕩約5min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡單快速、成本低、擴增效果好等優點，特別適合于大規模的基因型檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料
試驗材料為粳稻品種臺中65（T65）及其雜種不育基因Sc的近等基因系E5，以及它們雜交組合構建的F2群體，以及擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態型Columbia。

1.2 基因組DNA制備方法
剪取（或用手摘取）水稻苗或成株葉片（剪成約3～5mm小段）或擬南芥葉片約4～6mg，12～15mg，或25～30mg，放入2ml離心管中（注：2ml離心管的底部較寬，利于鎢合金珠的振蕩），加入200μl TE （10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0. 注：本TE中的EDTA濃度是常規TE的1/2）或200μl去離子水，放入一粒3mm直徑的鎢合金珠（Qiagen, Cat.69997），在多功能組織細胞研磨器（方統生物科技有限公司，型號MTM-60）上振動約5min，把葉片打碎。取17μl溶液以瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA質量，取1μl溶液用于PCR擴增。

1.3 PCR引物反應
根據公共數據庫的水稻和擬南芥基因組序列設計PCR引物（表1），由英俊公司合成。Taq酶從杰順公司購買。

表1  PCR引物序列

注：PA為擬南芥引物，其余為水稻引物，其中L14-121～P24-93為插入/缺失（InDel）標記引物。

每個PCR反應液（20μl）組成為：1× Buffer，0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq酶,250nmole/L每種引物，1μl上述DNA溶液。PCR反應在My Cycler (BioRad)熱循環儀上進行。用引物反應程序為94℃預變性3min，擴增35個循環，每個循環94℃ 20s， 55~58℃ 30s，72℃ 60s (InDel標記的PCR用30s)；最后72℃ 2min。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳及檢測　

1.4.1 聚丙烯酰胺凝膠的制備
配制6%的聚丙烯酰胺凝膠100ml工作液:分別加5.7 g丙烯酰胺 (Acri)，0.3g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis-Acri），12g尿素，10ml 10×TBE，最后加水至100ml。灌膠前，每10ml膠液加入80μl 10%過硫酸銨，4μl四甲基乙二胺(TEMED),搖勻后迅速灌膠，膠凝固后即可點樣電泳，并通過銀染檢測實驗結果。

1.4.2 銀染　
先用0.1% AgNO3染色液染色10～15min，再用顯影液（100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸鈉0.019g, 0.4mL甲醛）顯色,等條帶清晰后，直接用自來水沖洗終止顯色反應，用凝膠成像儀（BioRad）或數碼相機拍照并記錄實驗結果。