用克隆環分離細胞克隆

胰蛋白酶

硅油

克隆培養環 巴氏吸管 生長培養基 多孔板 無菌鑷 移液器 粗頭筆

1. 觀察細胞克隆，用氈制粗頭筆或 Nikon 標記筆（氈制粗頭筆或者最好用 Nikon 標記筆或物鏡標記筆，可插入顯微鏡物鏡換鏡轉盤的位置，對所選的克隆集落劃上標記）在培養皿底面對要分離的集落做標記。

2. 撤去培養基，用 D-PBS 輕輕沖洗細胞克隆。

3. 用無菌鑷夾取一個克隆培養環（放在培養皿中干熱或高溫高壓滅菌），蘸取硅油（于玻璃培養皿中160°C 干熱滅菌 1 h , 或121°C 高壓滅菌 15 min），硅油面朝下，壓放在培養皿上，使硅油均勻分布在克隆培養環底面。

4. 將環圈套于所需集落上。

5. 在同一培養皿重復步驟 4、5 , 圈套  2~3 個其他所需集落。

6. 加足量的 0.25 % 胰蛋白酶（D-PBS 配制的 0. 25 % 胰蛋白酶）充滿環內（0.1~0. 4 ml，取決于環內徑的大小）。

7. 保留 20s，后棄去。

8. 蓋上培養皿，37°C 下孵育 15 min 。

9. 每個環中加 0.1~0. 4 ml 的培養基。

10. 依次對每個克隆用吸管吹吸分散細胞，并將細胞懸液分別移入 24 孔板的一孔或豎直放置的 25 cm² 的培養瓶內，每個細胞克隆都分別使用獨自的吸管或槍頭（黃色槍頭或彎頭吸管和帶鈍頭的巴氏吸管）。

11. 再用 0.1~0.4 ml 的培養基沖洗克隆環，再將這些培養基分別移入相應的培養孔或培養瓶中。

12. 將培養孔中的培養基加至 1 ml，蓋好，繼續培養。如果用的是培養瓶，就在每個瓶中加 1 ml 的培養基，豎直放置培養。

13. 當克隆細胞長滿培養孔時，移至 25 cm² 培養瓶內，加 5 ml 培養基，常規培養。如果采用的是直立培養瓶法，當瓶底長滿細胞后，撤去培養基，胰蛋白酶消化，加 5 ml 培養基，平放培養瓶繼續培養。

培養皿暴露過長時間會變干， 所以要限制分離的克隆數量或在每步操作之間蓋上培養皿。