實驗材料 表達帶多聚組氨酸標簽的蛋白的大腸桿菌細胞
試劑、試劑盒 結合緩沖液咪唑洗脫緩沖液TritonX-100洗滌緩沖液SDS-聚丙烯酰胺凝膠
儀器、耗材 Sorvall SS-34 轉頭或相當的轉頭層析柱固化 Ni2+層析樹脂搖床
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
結合緩沖液（pH7.8)
20 mmol/L 磷酸鈉
500 mmol/LNaCl
咪唑洗脫緩沖液（pH6.0)
20 mmol/L 磷酸鈉
500 mmol/LNaCl
在洗滌緩沖液（pH6.0) 中加入適量 3mol/L 咪唑分別配成 10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L 和150 mmol/L 的咪唑洗脫緩沖液。
TritonX-100(10%V/V)
洗滌緩沖液（pH6.0）
20 mmol/L 磷酸鈉
500 mmol/LNaCl
酶和緩沖液
DNase(1 mg/ml)
溶菌酶
RNase（1 mg/ml)
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%）
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備參考附錄 8。
離心機和轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或相當的轉頭
特別配備
層析柱（玻璃或聚丙烯）
固化 Ni2+層析樹脂（如 ProBond,Invitrogen 公司；HisTrap,Pharmacia 公司；His.Bind Resin,Novagen 公司；NTA-Ni2+-瓊脂糖，Qiagen 公司）
目前最常用的金屬螯合親和載體是次氨基蘭乙酸酯（NTA)-Ni2+-瓊脂糖，可從上述公司購買，另外還有不同性質的其他載體。據說一種獨特的 Co2+螯合物（Talon) 對 His-6 的親合力更高，選擇性也更強,但在實驗室再生不方便. 因此成本也就更高。
搖床
載體和細菌菌株
表達帶多聚組氨酸標簽的蛋白的大腸桿菌細胞（方案 1、2、3 或 4 產生）。
方法
Ni2+親和柱的制備
1. 輕輕顛倒混勻固化 Ni2+樹脂，取 2 ml 裝入層析柱，樹脂自然沉降。
2. 用 3 倍柱體積的無菌水沖洗樹脂。
樹脂沉降后的體積為 1 個柱體積。
3. 用 3 倍柱體積的結合緩沖液（pH7.8) 平衡樹脂，放置待第 9 步使用。
制備細胞抽提物
4. 每 100 ml 細胞培養物的細胞沉淀（方案 1 步驟 17) 懸于 4 ml 結合緩沖液（pH7.8)。
5. 加入溶菌酶至終濃度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在親和純化帶組氨酸標簽蛋白之前，采用超聲或 French 壓的方法裂解細胞。使用溶菌酶的方法重復性更好，而且不會引起細胞的災難性裂解，后者釋放外膜蛋白和能引起帶組氨酸標簽蛋白聚集的其他分子。
注意：可以加入蛋白酶抑制刑，但不能加入 EDTA 或其他螯合劑，因為它們會將 Ni2+從樹脂上帶下來. 破壞樹脂對組氨酸的親合力。
6. 混和物于 4°C 搖床上孵育 10 min。
7. 加入 Triton X-100、DNase 和 RNase, 終濃度分別為 1%、5ug/ml 和 5ug/ml，再于 4°C 搖床上孵育 10min。
8.4°C 3000 g(5000 r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 30 min, 去除不溶性細胞碎片。上清（細胞裂解物）轉移到一只新管中。
為防止純化過程中樹脂被堵塞, 上淸需要用 0.45 濾膜過濾。
純化帶組氨酸標簽蛋白
9. 樹脂上的結合緩沖液引流到柱頂部。
10. 步驟 8 獲得的細胞裂解液上清上柱，流速調整為每小時 10 個柱體枳。
1 ml Ni2+親和樹脂能結合大約 8~12 mg 蛋白。帶多聚組氨酸標簽的蛋白在大腸桿菌中的產量因靶蛋白而異，但一般都在每 100 ml 培養物蛋白之間 。
11. 用 6 個柱體積的結合緩沖液（pH7.8) 洗柱。
12. 用 4 個柱體積的洗滌緩沖液（pH6,0) 洗柱，直至流過液 A280<0.01。
13. 用 6 個柱體積的 10 mmol/L 咪唑洗脫緩沖液洗脫結合的蛋白，每份 1 ml 分步收集，監測 A280。
14. 用咪唑濃度更高（50 mmol/L、100 mmol/L 和 150 mmol/L) 的洗脫緩沖液重復步驟 13。
也可用 10~100 mmol/L 連續梯度咪唑洗脫緩沖液洗脫結合的蛋白，多數組氨酸標簽蛋白在 50~100 mmol/L 之間被洗脫。如果不使用咪唑，還可以用 pH 遞降的緩沖液洗脫（請參考替代方案：用 pH 遞降的緩沖液從金屬親和柱洗脫多聚組氨酸標簽蛋白）。
15. 用 20ul 等份的蛋白進行 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析聚組氨酸標簽蛋白的分布。