實驗材料 限制性內切核酸酶大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段模板 DNA
試劑、試劑盒 乙酸銨乙醇dNTP 溶液
儀器、耗材 Sephadex G-50 離心柱水浴
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙酸銨（10 mol/L )
乙醇
2. 酶和緩沖液
適宜的限制性內切核酸酶
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
3. 核酸和寡核苷酸
含適當未標記的 dNTP 各 1 mmol/L 的 dNTP 溶液
模板 DNA ( 0.1~5 μg )
4. 放射性復合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性為 800~3000 Ci/mmol）
5. 專用設備
Sephadex G-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡
預先設定至 75℃ 的水浴
二、方法
1. 在 25~50 μl 的適當的限制酶緩沖液內，用所需限制酶消化高達 5 μg 模板 DNA。
2. 向完成的限制酶消化反應中，加入：
10 mCi/ml [α-32P] dNTP
（比活性 800~3000 Ci/mmol） 2~50 μCi
未標記的 dNTP 至終濃度為 100 μmol/L
Klenow 片段 1~5 單位
室溫溫育反應 15 min。
3. 于 75℃ 加熱 10 min 以終止反應。
4. 用 Sephadex G-50 離心柱層析分離放射性標記的 DNA 與未摻入的 dNTP 或在 2.5 mol/L 乙酸銨存在下進行兩輪乙醇沉淀。