第 3 階段：RNA 寡核苷酸的制備
選擇離 T7 或 T3RNA 聚合酶作用位點下游約 lOObp 處可以線性化的質粒 [見圖 25-3(b)]。因為來自多克隆位點回文序列的引物用于 PCR 效果不好，因此比較理想的是用在多克隆位點克隆進某個插入片段的質粒。一個已經驗證過的質粒是 pBS-SK-GBX-l-3'UTR,它是在 pBS-SK(Stratagene) 的 Sst I 位點克隆進了小鼠的 Gbx-1(Frohmanetal.1993) 基因的 3'非翻譯區。它可以用 SmaI 線性化，并用 T3RNA 聚合酶轉錄，產生一段 132 個核苷酸的 RNA 寡核苷酸。除了 17 個寡核苷酸外，其他均來自 Gbx-1。需要注意，如果可以找到合適的酶切位點，腺苷酸是 3'末端寡核苷酸連接到靶序列 5'末端的最好的「受體」。后面擴增所用的引物都是 3'非翻譯區的序列。Gbx-1 NRC 引物的序列和質粒可以向Frohman 實驗室索取。要進行轉錄測試，以確保各種組分正常工作，然后再放大反應體系。寡核苷酸可以長期保存于-80°C 備用。由于純化和斑點檢查操作損失很大，因此合成足夠的寡核苷酸是很重要的。
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
氯仿
乙醇
焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的 H20
rUTP 溶液，10 mmol/L
rATP 溶液，10 mmol/L
rCTP 溶液，10 mmol/L
rGTP 溶液，10mmol/L
DTT(0.lmol/L)
苯酚/氯仿（1:1, 體積比）
乙酸納，3mol/L，pH5.2
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶緩沖液
合適的內切酶和相應的緩沖液
胰腺 DNA 酶 I(無 RNA 酶）
蛋白酶 K
依賴 DNA 的 RNA 聚合酶
RNasin
轉錄緩沖液， 5X ( 由制造商提供）
3 . 核酸和寡核苷酸
質 粒 模 板 DNA
4 . 特殊設備
合 適 規 格 的 Microcon 過 濾 器（見第 7 步）
預 設 為 37°C 的水浴或加熱儀
5 . 其他
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包 括 溴 化 乙 錠
二、方法
1. 用合適的內切酶和緩沖液，線 性 化 25ug 的 質 粒 DNA, 以 用 于 轉 錄（質粒中要確保沒 有 R N A 酶）。
2. 用 50ug/ m l 的 蛋 白 酶 K 于 37°C 消 化 處 理 30 min, 然后用苯酚/ 氯 仿 抽 提 兩 次 ，氯仿再抽提一次。用標準的無水乙醇沉淀法收集 DNA。
3. 用 25ul 的 T E ( pH8 . 0 ) 重 溶 模 板 DNA, 其 終 濃 度 約 為 lug/ ul 。
4. 室溫下，在一個滅菌的管中按下列順序混合以下轉錄試劑。
37°C 溫育 1h
5. 轉錄之后，每 20ul 反應體積加 0.5ulDNA 酶（無 RNA 酶），37°C 溫育 10min，以去掉 DNA 模板。
6. 取 5ul 驗證反應或制備反應的產物，跑 1% 的瓊脂糖凝膠電泳（TAE)，以檢測寡核苷酸產物。除在膠的上下都會有一些拖尾外，在產物的預期大小（或稍小）的位置，會有一條彌散的帶。
7. 用苯酚/氯仿抽提，用氯仿再抽提，以純化寡核苷酸。用水漂洗 3 遍，然后過 Microcon(Millipore) 過濾器（預先用水浸泡）。
Microcon30 過濾器的截留值為 60nt,Microcon100 過濾器的截留值為 300nt。如果寡核苷酸小于100nt, 則 MicroconlO 過濾器也許是最合適的。對于更大的寡核苷酸，可以用 Micrcon30 過濾器。
8. 另取一份適量的寡核苷酸樣品，跑 1% 的瓊脂糖凝膠電泳（TAE)，檢測樣品的完整性和濃度。分裝后保存于-80°C。
第 4 階段：RNA 寡核苷酸與細胞 RNA 的連接
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ATP，2 mmol/L
2. 酶和酶緩沖液
連接緩沖液，lX(500 mmol/LTris-HCl、pH7.9，100 mmol/MgCl2，20 mmol/LDTT，1mg/mlBSA)
RNasin
T4RNA 連接酶
3. 核酸和寡核苷酸
RNA 寡核苷酸，由上面第 3 階段制備
TAP 處理過和沒有處理過的 RNA 樣品
4. 特殊設備
Microcon100 過濾器
預設為 17°C 的水浴或加熱儀
5. 其他
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠
二、方法
1. 取兩個無菌的離心管，一個加 TAP 處理過的細胞 RNA，另一個加沒處理過的細胞 RNA。
連接緩沖液（10X) 3ul
RNasin(40U/ul) 0.75ul
RNA 寡核苷酸 4ug*
TAP 處理（或非處理）的 RNA 10ug
ATP(2 mmol/L) 1.5ul
T4RNA 連接酶（20U/ul) 1.5ul
H2O 至 30ul
*比目的細胞 RNA 多 3~6mol
2.17°C 過夜反應 16 h。
3. 用 Microcon100 過濾器純化連接產物（用水洗 3 遍，過濾器預先用無 RNA 酶的水沖洗），回收體積不應超過 20ul。
4. 取 1/3 體積的連接產物，進行 1%TAE 瓊脂糖凝肢電泳，以檢查連接 RNA 的完整性。它應該沒有多大變化。
第 5 階段：反轉錄
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)
DTT,0.1mol/L
TE(10mmol/LTris-HCl,pH7.5,lmmol/LEDTA,pH8.0)
2. 酶和酶緩沖液
反轉錄緩沖液 5X(由制造商提供）
RNA 酶 H
RNasin
SuperscriptII 逆轉錄酶（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
反義特異性引物（20ng/ul)，或六堿基隨機引物（50ng/ul)
連接寡核苷酸的 RNA，由上面第 4 階段制備
4. 特殊設備
預設為 37°C、42°C、50°C、70°C 的水浴或加熱儀
二、方法
1. 在一個無菌離心管中，于冰浴上混合以下轉錄組分。
反轉錄緩沖液，5X 4ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1ul
DTT(0.lmol/L) 2ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2. 在另一個管中，將剩余的 RNA(約 6.7ug) 溶于 13ul 水中，加入 20ng 的反義特異性引物或 50ng 的六堿基隨機引物，80°C 溫育 3 min, 迅速在冰上冷卻，在離心機中離心 5s。
3. 將 RNA/引物混合物加入到反轉錄組分中，然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆轉錄酶，42°C 溫育 lh, 然后 50°C 溫育10min。如果用的是隨機引物，在混合了各組分之后，加一步室溫溫育 10min 的反應。
4.70°C 溫育 15 min，使逆轉錄酶失活，再離心 5s。
5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H,37°C 溫育 20 min, 以破壞 RNA 模板。
6. 用 TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA) 將反應混合物稀釋至100ul，4°C 保存（這就是 5'末端寡核苷酸-cDNA 文庫）。
第 6 階段：擴增
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
DMSO
2. 酶和酶緩沖液
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10mmol/L)
Taq 聚合酶（原文缺。—譯者加）
Taq 聚合酶緩沖液（10X)
3. 核酸和寡核苷酸
5'末端寡核苷酸-cDNA 文庫（由第 5 階段第 6 步得到）
寡核苷酸引物 GSP1、GSP2、NRC1 和 NRC2(NRC1 和 NRC2 引物的細節見圖 25-4)
4. 特殊設備
可設程序的熱循環儀
二、方法
1. 第一輪
(1) 在一個無菌的 0.2 ml 離心管中混合以下組分。
Taq 聚合酶緩沖液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
DMSO 5ul
Tag 聚合酶 2.5U(原文缺。-—譯者加）
H20 加至 50ul
(2) 取 5'末端寡核苷酸-cDNA 文庫 1ul，加入 GSP1 和 NRC1 引物各 25pmol。
(3) 在 DNA 熱循環儀上 98°C 加熱 5 min, 使第一鏈產物變性，并激活聚合酶。冷卻至合適的溫度（56?68°C) 退火 2 min,72°C 延伸 40 min。
(4) 按下列程序進行 30 個（原文為 35 個。一譯者改）擴增循環。
2. 第二輪
(5) 取第一輪的部分擴增產物，用 TE 以 1:20 稀釋。
(6) 用上面介紹的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 min 的延伸步驟, 用 GSP2 和NRC2 引物擴增 1ul 稀釋樣品。