用流式法（FACS)分離間質SP細胞實驗

2?4代的間質細胞                                                          

HBSS 2FB                                                                  Hoechst33342染料 lmg ml水溶                                                                  碘化丙啶（PI) 2mg ml水溶                                                                  維拉帕米 500μg ml水溶                                                                  DMEM 2FB                                                                  胰蛋白酶 TrypLE:TrypLEExpress或0.25%胰蛋白酶 溶于CMF-SalineG                                                          

MoFlo(或與其類似的）高速細胞分選儀                                                                  具備350 nm激發能力                                                          

(a)胰蛋白酶消化2?4代的間質細胞。

(b)細胞計數，用DMEM/2FB將細胞稀釋至1×10⁶個細胞/ml。

(c）加入5μg/mL (Hoechst33342染料，37℃，90 min，每20 min攪動一次。

(d)對照組細胞在加人Hoechst33342染料前，先加入50μg /ml維拉帕米孵育20min。

(e)染色后，在4℃環境下用HBSS/2FB將細胞洗兩遍并離心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重懸細胞。

(f)于分選前加入2μg/ml PI以鑒別無活性的細胞。

(g)無菌條件下分選細胞，高速細胞分選儀，用350nm激發。收集藍色（670 nm)和紅色（450 nm)熒光均減弱的細胞。邊群細胞通過上述步驟與死細胞和完全被染料標記的細胞分離開并被收集起來。對照組要確保用維拉帕米先行孵育后使邊群細胞消失。