用突變的VlCDR3構建SCFv基因文庫

實驗概要

本實驗用突變的VlCDR3構建了SCFv基因文庫。

主要試劑

1. 去離子水(Millipore)

2. VentDNA聚合酶和緩沖液(NEB)

3. 20XdNTP(每種濃度5mmol/L)(NEB)

4. 瓊脂糖膠盒

5. Geneclean試劑盒(QbiOgene)

6. 含有起始scFv基因的質粒DNA

7. LMB3引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)，10pmol/ul

8. VLFOR隨機引物，10pmol/ul

主要設備

PCR熱循環儀

實驗步驟

1．設計合成含有CDR3隨機化序列的V_LFOR引物。當然，此引物必須以擬進行親和力成熟的抗體V_L基因作為基礎進行設計。本實驗中，V_LCDR3的7個氨基酸被隨機化。在每個隨機化位點中，保留了大約50％野生型氨基酸。引物設計結果如下：

V_LFOR隨機引物：5’-CCC TCC GCC GAA CAC CCA ACC 524 513 524 524 542 541 511 CTG GCA GTA ATA ATC AGC CTC-3’

數字對應摩爾分數如下。

   1) A(70％)、C(10％)、G(10％)、T(10％)。

   2) A(10％)、C(70％)、G(10％)、T(10％)。

   3) A(10％)、C(10％)、G(70％)、T(10％)。

   4) A(10％)、C(10％)、G(10％)、T(70％)。

   5) G(50％)、C(50％)。

利用分子建模去識別哪個CDR3殘基具有溶劑可接近側鏈，來確定隨機化殘基。

2．配制4個50w1 PCR反應混合液，包含：

   1) 去離子水，35.5ul

   2) 20XdNTP，2.5ul

   3) 10XVent聚合酶緩沖液，5.0ul

   4) lMB3引物(10pmol/ul)，2.5ul

   5) VI-FOR引物 (10pmol/ul)，2.5ul

   6) 野生型scFv基因模板DNA(100ng)，1.0ul

   7) VentDNA聚合酶(2單位)，1.0ul

3．在有加熱蓋的熱循環儀內加熱混合液到94℃，5分鐘。

4．以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環30次，擴增V_L基因。

5．在1％瓊脂糖膠上膠純化V_L基因(接近800bp)；用Geneclean試劑盒提取DNA。將每種產物重懸于20ul水中。在1％瓊脂糖凝膠上與已知大小和濃度的標準對照品比較，測定DNA濃度。