用蝕斑試驗測定病毒貯液的滴度實驗2

病毒常殺死被病毒感染的細胞 即產生致細胞病變作用。用只染活細胞（如中性紅）或只染死細胞（如臺盼蘭）的染料對單層細胞染色以檢測空斑。也可以使用活性染料溴化二苯基四氮唑(MTT) 進行染色，使用 MTT 的優點是黃色的 MTT 能將活細胞染成深藍色，由于反差明顯，計數時不必去除含酚紅的凝膠層，且在感染早期即能觀察到開始形成的小空斑，可用于分離被病毒轉化或對病毒抵抗的細胞。

雞胚成纖維細胞

2%~5%小牛血清的 0. 5% 水解乳蛋白的 Hanks 稀釋液

培養瓶co2培養箱

(1) 選擇經 24h~48 h 培養的 4X10⁶/ ml 雞胚成纖維細胞若干瓶。

(2) 將細胞瓶按病毒稀釋度分組標記，每個稀釋度為 2 瓶，對照 2 瓶。

(3) 配制含 2%~5%小牛血清的 0. 5% 水解乳蛋白的 Hanks 稀釋液 100ml:0. 2%或 0. 5%Hanks 液 97 ml(也可用 Eagle MEM 或 RPMI 1640 培基），滅活小牛血 2 ml,雙抗(10 000U/ml )1ml, 調 pH 至 7. 4~7. 6 。

(4) 在冰浴盤內用稀釋液將病毒作一系列 10倍遞增稀釋。

(5) 用 Hanks 液 (pH 約 7.8) 洗滌細胞層約 1~2 次（輕洗勿使細胞脫落）。

(6) 將每個病毒稀釋液接種 2瓶細胞，每瓶（小方瓶）接種 0. 5 ml 病毒（大方瓶接種 1 ml入輕輕搖勻。

(7) 置 37℃ 5%CO₂ 培養箱中吸附 1 h, 中間搖動一次，切勿倒置。

(8) 加含培養基的融化瓊脂，每大瓶加 10 ml 每小瓶加 5 ml, 控制溫度在 45℃~50℃左右加入，以防凝固。培養基瓊脂配制法： 6 ml 滅活小牛血清， 1 ml 雙抗 (20 000U/ml), 1 ml 卡那 (20 000U/ml), 90 ml 0. 5% Hanks 液，2~3 ml 7. 5% NaHCO₃, 加入等量 56℃ 融化的 3% Hanks 瓊脂液并搖勻。

(9) 冷凝后翻轉細胞培養瓶，置 37℃5%C0₂ 培養箱中培養 24 h 。

(10) 每瓶中加入 0.2% 中性紅，小瓶 0. 25 ml( 大方瓶加 0. 5ml) 搖勻， 37℃ 5% CO₂ 培養箱中培養 4 h 后，翻轉培養瓶繼續培養。（注：若需保存空斑時，可在每瓶中加人 3%氯化采 0. 5 ml, 并攝影記錄）。

(11)A 組蟲媒病毒培養 24 h,B 組蟲媒病毒培養 72 h 觀察結果。

注意：①各稀釋度病毒在稀釋時，每個稀釋度均應取新吸管將病毒液來回吹打三次（或輕輕振搖混勻），當加至各細胞瓶時應加至無細胞層的瓶壁側底角，然后傾斜并來回搖動使病毒與整個細胞層均勻接種改）②加中性紅時也應傾斜，輕搖，使中性紅均勻復染整個瓊脂表面，然后將瓶子翻轉培養。培養液可用 Eagle 或 RPMI 1640 替代 0. 5%Hanks 液。

1. 對細胞的要求 空斑形成單位試驗對細胞的制備要求十分嚴格，細胞單層一定要均勻，致密尤孔，鏡檢細胞形態和分裂良好，接種病毒前，要精心挑選合格的細胞瓶或培養板使用。

2. 對病毒的要求 稀釋病毒時，考慮到一些病毒對熱較敏感，故稀釋應在冰浴中進行，避免強光和反復凍融。稀釋時不應有泡沫，每一稀釋度換 1支新吸管或吸頭，接種體積應較少， pH保待在 7. 2~7. 4 。

3. 對培養基的要求 加入瓊脂覆蓋培養基后，應避光培養，因內含的中性紅遇光易分解，其分解產物對細胞有毒性作用，并影響染色效果。中性紅與細胞接觸后 30 min 左右，在光鏡下可見到細胞漿中因攝取中性紅而呈淡粉紅色，證實細胞有活力。

病毒濃度較高的細胞瓶于培養后可出現病毒空斑融合現象，空斑完全融合者，細胞層不染色面瓊脂層著紅色，反之，病毒稀釋度過低的細胞瓶，由于不含病毒顆粒而無空斑形成，則細胞層一片紅染，但瓊脂層不著色，根據這一點可將空斑完全融合與未出現空斑區別開來。

4. 對觀察計數的要求 必須當空斑數目達到穩定，不再增多時方可計數，否則結果不準確。試驗時，培養瓶應翻轉培養，以除去水滴在瓊脂面流動，避免各個空斑交叉融合，中性紅加入時間應在空斑出現前，在暗處培養，以防止染料抑制病毒和破壞細胞。對那些生長較慢的病毒空斑，中性紅則不是加在最初的覆蓋層里，而是加在經過幾天培養后的最后一層覆蓋層上，可使培養物維持更久，甚至有的中間還得補加營養瓊脂覆蓋層 1-2 次。空斑使用的瓊脂往往含有少量抑制物而影響空斑的產生，應將瓊脂用單蒸水浸泡過夜，再用單蒸水沖洗 2-3 次，而后用去離子水沖洗 1-2 次后，用 Hanks 液配制成 3%濃度，煮沸 1h 除菌備用。有人在試驗時補加 25mM 的 MgCl₂ 或 CaCl₂ 及 1 mM 半胱氨酸，可加強腸道病毒形成蝕斑。而 MgCl₂ 的加強作用最強。

病毒的效價或滴度可根據空斑數和標本稀釋度直接計算，計算結果以每 ml 病毒樣品的空斑形成單位 (PFUs) 表示。其方程式如下：

空斑形成單位 (PEUs/ml) =(X₁+X₂+ …+X_n )·d/（n·v）

這里 X₁、 X₂、 X_n表示同一稀釋度不同培養板孔（試驗單位）中數得的空斑數； n 表示計數空斑的培養板孔數（試驗單位數）； v 表示病毒量 (ml) ;d 表示稀釋倍數。

（二）空斑形成單位 (PFUs) 與重復感染數 (M. O. I)

在病毒學試驗中，經常用到重復感染數 (Multiplicity of Infection, M. O. I) 。重復感染數(M. O. I) 是指感染一個細胞的病毒顆粒的平均數。

在研究病毒感染細胞的分布規律時，首先了解到一個有趣的現象是：當足夠量的活病毒與足夠量的活細胞相遇（如相混合）時，病毒感染細胞（包括吸附、進入）的機會既是均等的又是獨立的。所謂「獨立的」，即指在 1個病毒顆粒感染 1個細胞后，并不影響其它病毒顆粒再繼續感染該細胞。顯然，病毒感染細胞分布的這一規律是符合泊松分布的。泊松分布是表示在一定條件下，離散、隨機、變量的分布情況。如當病毒與細胞相遇后，單個細胞可能會被 0 、 1 、 2 、3 、…… n個病毒顆粒感染。

計算 M.O.I 的公式為 m=-ln P[0]

m 為 M.O.I 的縮寫

P[0]= 未感染細胞的比例

In= 自然對數

在大多數病毒感染時，細胞感染情況可分為三種。

未感染的細胞 P[O]=e^-m

由一個病毒顆粒感染的細胞 P[1]=me^-m

被多個病毒顆粒感染的細胞 P[>1]=1 - e^-m(m+1)

從上面的公式可推導出，若 M.O. l=0. 01, 則未感染的細胞比例為 P[O]=e^-m=2. 718^-0.01 =

0. 99=99%, 那么感染細胞的比例為 1% 。同樣，若 M.O. l=0.1, 則未感染細胞的比例為 P[O]=

e^-m=2. 718^-0.1=0. 90=90%, 那么感染細胞的比例為 10%, 所以 M.O.I 值越大，則實驗細胞被感染的比例越大。