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材料
無菌：D-PBSA、0.25% 粗制胰蛋白酶、生長培養基、移液器黃吸頭
非無菌：移液器，20ul 或 100ul 可調式、血細胞計數板（改良的 Neubauer）、數字計數器、顯微鏡
操作步驟
1. 細胞取樣
（a）單層培養
（i）如常規培養那樣用胰酶消化單層培養的細胞（見方案 13.2），用培養基重懸細胞至濃度約 1X106 個/ml。對樣本進行計數時，不用將胰酶消化液去除，可用胰酶液將細胞吹打分散，直接進行計數。如果細胞聚團，可用含血清的培養基進行倍比稀釋（50:50）再計數。
（ii）充分地混勻細胞懸液使之盡量分散成單個細胞，轉移一小部分樣本（約 1 ml）至小瓶或常用容器中。
（b）懸浮培養
（i）充分地混勻細胞懸液使細胞盡量分散不聚集。
（ii）轉移 1 ml 的細胞懸液至小瓶或常用容器中。
在本方法中，所需要的細胞最低濃度大致為 1X106 個/ml。因而細胞懸液需要被離心（100 g，2 min），然后重懸于一個便于計數的更小的體積之中。
2. 準備血細胞計數板
（a）用 70% 的乙醇清洗計數板表面，注意不要劃傷銀的表面。
（b）清洗蓋玻片，在邊緣稍微沾些水，然后將蓋玻片壓到計數板的凹槽和半銀的計數區域上（圖 21.1）。當出現干擾圖像（「牛頓環」，或在計數板與蓋玻片之間出現類似水面上的油滴那樣的五顏六色的彩虹環）時，說明蓋玻片已被正確放置，計數小室的深度也已被確定。
3. 充分混合細胞樣品，用力吹打以分散所有的細胞團塊，然后用巴斯德吸管或移液器槍頭吸取 20?l 的樣品。
4. 立即將細胞懸液移到血細胞計數板小室的邊緣，從吸管中擠出細胞懸液，利用毛細作用使之充滿計數板和蓋玻片的空隙。小室內的液體既不能多，也不能少；以液體剛好流到計數板凹槽的邊緣為準，否則由于表面張力的改變，小室的容積將發生改變。
5. 按照上面的操作，將計數板的另一個小室用細胞懸液充滿。
6. 洇干多余的液體（但不要帶出蓋玻片下的細胞懸液），把計數板放在顯微鏡載物臺上。
7. 選擇一個 10X 物鏡，利用網格線對焦（圖 21.1）。如果由于對比弱而使聚焦困難，可以調節可變光闌，減少進入的光線，或者通過偏置聚光器而使光線略微傾斜。
8. 移動計數板，使鏡下的視野恰好是整個網絡區域中心的一個大方格，而且是你所能看到的以 3 條平行線為界的最大范圍。由于目鏡的原因，大方格的四個角有可能略微位于視野之外（圖 21.1）。
9. 利用更細的劃分區域（同樣以 3 條平行線分界）和單線網格線來計算這一 1 mm2 范圍內的細胞數。為了避免重復計算，壓線的細胞只計算左線和上線者，右線和下線不計算在內。對于常規的傳代培養來講，細胞數在 100 ~300 個/mm2 即可；計數的細胞越多，計算的結果越準確。若要進行需精確定量的實驗，所數的細胞數應在 500~1000 個。
（a）如果視野內的細胞過少（<100/mm2），需要額外計算中心大方格周圍的一個或多個大方格（每個方格 1 mm2）。
（b）如果視野沒的細胞過多（>100/mm2），只需要計算大方格（1 mm2）對角線上的 5 個小方格（每個小方格以 3 條平行線為邊界分隔）。
10. 如果計數板有兩個小室，可以將第二個小室移入視野內進行第二次計數。或者沖洗計數板，重新加上細胞樣品進行再次計數。 
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