此方案中 cDNA 的合成是在 4 種飽和濃度的 dNTP 及一種痕量的放射性標記的 dNTP 中進行的。扣除雜交后，在大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下，富集的單鏈 cDNA 通過隨機寡核苷酸引物延伸的二次合成反應，標記成高比活性的探針。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 此方案中 cDNA 的合成是在 4 種飽和濃度的 dNTP 及一種痕量的放射性標記的 dNTP 中進行的。扣除雜交后，在大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下，富集的單鏈 cDNA 通過隨機寡核苷酸引物延伸的二次合成反應，標記成高比活性的探針。由 于第一輪反應中 dNTP 的濃度為非限制性的，所生成 cDNA 的量及大小均高于標準方案，因此扣除雜交步驟以高效進行。由此產生的 cDNA 群體不易受輻射分解的破壞，從而可長期貯存，必要時尚可標記成較高比活性的探針。 |
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| 實驗材料 | 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段反轉彔酶隨機脫氧核苷酸引物模板 mRNA |
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| 試劑、試劑盒 | 二硫基蘇糖醇乙醇EDTANaOH胎盤 RNA 酶抑制劑隨機引物緩沖液醋酸鈉dNTP 溶液 |
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| 儀器、耗材 | Sephadex G-50 離心柱微量離心管水浴 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
二硫基蘇糖醇（DTT) (1 mol/L）
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盤 RNA 酶抑制劑
5X 隨機引物緩沖液（250 mmol/L Tris ( pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 調至 pH 6.6)，使用 1 mol/L DTT 貯存液的新稀釋水溶液，貯存于 -20℃。用后棄去稀釋的 DTT。）
SDS ( 20% m/V)
醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)
Tris-Cl (1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶與緩沖液
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
反轉彔酶
10X 反轉錄酶緩沖液
3. 核酸與寡核苷酸
含 4 種 dNTP 各 5 mmol/L 的（完全）dNTP 溶液
含 dCTP、dGTP 和 dTTP 各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液
oligo (dT)12-18
長度為 6 或 7 個堿基的隨機脫氧核苷酸引物
模板 mRNA
4. 放射性復合物
[α-32P] dATP ( 10 mCi/ml，比活性為 >3000 Ci/mmol）
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性為 800~3000 Ci/mmol）
5. 專用設備
Sephadex G-50 離心柱，平衡于 TE（pH 7.6)
硅化的微量離心管（1.5 ml）
預熱至 45℃、60℃ 和 68℃ 的水浴
二、方法
1. 4℃ 下在一個滅菌的微量離心管中混合下列成分以合成 cDNA 第一鏈：
模板 RNA (1 mg/ml） 10 μl
oligo(dT)12-18 （1 mg/ml） 10 μl
5 mmol/L dNTP（完全）溶液 10 μl
50 mmol/L DTT 1 μl
10X 反轉錄緩沖液 5 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP 5 μl
( 比活性 800 或 3000 Ci/mmol）
胎盤 RNA 酶抑制劑 25 單位
無 RNA 酶的水 加至 46 μl
反轉錄酶（~800 單位） 4 μl
2. 檢測放射性標記的 dNTP 摻入 TCA 可沉淀物或結合于 DE-81 濾膜的比率。用下列公式計算 cDNA 第一鏈的產率。
3. 加入下列試劑以終止反應：
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 μl
20% (m/V) SDS 2 μl
充分混勻微量管中的各成分。
4. 在反應管中加入 5 μl 3 mol/L NaOH，于 68℃ 溫育反應 30 min 以水解 RNA。
5. 將反應物溫度冷至室溫。加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4)，充分混勻以中和溶液，然后加 5 μl 2.5 mol/L HCl。點一小滴溶液（<1 μl）在 pH 試紙上以檢測溶液的 pH。
6. 用酚:氯仿抽提純化 cDNA。
7. 用 Sephadex G-50 離心柱層析分離放射性標記的探針與未摻入的 dNTP。
8. 進行兩輪扣除雜交。
9. 用異丁醇序貫抽提濃縮 cDNA，通過 Sephadex G-50 層析除鹽。
10. 用標準乙醇沉淀回收 cDNA。將 cDNA 溶于水，終濃度為 15 ng/μl。
11. 為了對扣除 cDNA 進行高比活性的放射標記，在一個 0.5 ml 微量離心管中混合下列成分：
扣除 cDNA 5 μl
隨機脫氧核苷酸引物（125 μg/ml） 5 μl
12. 加熱混合物至 60℃ 5 min，然后冷卻到 4℃。
13. 向引物：cDNA 模板混合物中加入：
5X 隨機引物緩沖液 10 μl
含 dCTP、dGTP 和 dTTP
各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液 5 μl
10 mCi/ml [α-32P] dATP
( 比活性為 >3000 Ci/mmol） 25 μl
Klenow 片段（12.5 單位） 2.5 μl
水 加至 50 μl
室溫下反應 4~6 h。
14. 加入下列試劑以終止反應：
0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 1 μl
20% (m/V) SDS 2.5 μl
15. 用 Sephadex G-50 離心柱層析分離放射性標記的 cDNA 與未摻入的 dNTP。 |
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