用BioRad385GradientFormer灌制線性梯度凝膠實驗

丙烯酰胺濃度逐漸增加(凝膠孔徑線性減小）的線性梯度凝膠有著更多的優點。首先，線性梯度凝膠可以分離更大分子量范圍的蛋白質。其次，它還能將分子量非常相近的蛋白質分離開。最常用于梯度膠的丙烯酰胺濃度是4 % ?20 % ，但具體采用哪一范圍的丙烯酰胺濃度還是取決于被分離的蛋白質的大小（見表2.2和表2.4)。

異丁醇 丙烯酰胺

制膠板 梯度混合 攪拌 子

（1）計算每一凝膠灌制模具所需溶液體積。

a?用間隔片的厚度乘以要灌制的凝膠的長、寬及膠的數目后，再除以2。

b.裝好凝膠灌制模具后，加水至所需位置，測量用去的水的體積，并除以2。注意在灌制凝膠前灌膠裝置必須是干燥的。

(2)從凝膠灌制模具頂部或底部灌入凝膠溶液。

①從頂部灌入：

a.裝好凝膠三明治夾板，如圖2.6所示。

b?剪短連接管，使流出管的夾子和泵，以及泵與三明治夾板之間的距離最短。連接管與梯度混合器和蠕動泵。用膠條將管的末端固定在玻璃板中間。

c?將攪拌子放進混合器。

d.根據想要達到的樣品分離效果，配制合適的、不含聚合引發劑的丙烯酰胺輕液（濃度低的凝膠溶液）和重液（濃度高的凝膠溶液）（見表2.2和表2.4)。如有必要，適當排氣。

e.往輕液中加人聚合引發劑，迅速混合均勻后倒入貯液池。這時的腔間閥一定要處于關閉狀態。

f.將聚合引發劑加人重液，混合后倒人混合器。

g.開啟磁力攪拌器，調整速度，使漩渦底部與輕液中的漩渦底部在同一高度。

h.打開腔間閥和流出管的夾子，啟動蠕動泵。設定的速度要能使所有梯度溶液在10min內泵進凝膠灌制模具（如10ml/mm)。

i.當所有溶液都泵入三明治夾板中后，關閉蠕動泵。

J?從凝膠灌制模具上移開連接管，放置于廢液缸中。

k.在凝膠層上鋪上水飽和的正丁醇。

l.在每個灌制模具中都加入水，把蠕動泵開啟到最大速度沖洗這個系統。

②從底部灌入：

a.如果使用底部有一個墊圈的凝膠灌制腔，用管將泵和這個墊圈相連。

b?遵循上面的步驟，直至完成步驟h。但不同的是，這里要將輕液倒進混合池，而重液倒進貯液池。

c.當所有丙烯酰胺溶液都進入凝膠灌制腔時，關掉蠕動泵，小心別讓氣泡進入灌制腔。

d?完成上面的步驟j?1。