試劑、試劑盒 ddH20Vent 緩沖液Vent DNA 聚合酶dNTP引物質粒 DNA
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備熱循環儀
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ddH20
2. 酶和酶緩沖液
10X Vent 緩沖液
Vent DNA 聚合酶
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP，各 20 mmol/L
引物，可以與合成的 DNA 文庫克隆位點兩側的載體序列退火
質粒 DNA(見下面第 1 步）
4. 特殊設備
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠 (見第 5 步）
熱循環儀
二、方法
1. 在細菌中擴增后，用隨機多肽文庫制備的質粒進行下面的反應。
10~50ng 的質粒 DNA
50pmol 的各引物
5ul 的 10X Vent 緩沖液
dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul
1U 的 Vent DNA 聚合酶
用 ddH20 定容至 50ul
下面的各種質粒載體，應該分別進行反應：
表達載體，沒有文庫 DNA 插入
DNA 文庫的混合物
少量 DNA，由 DNA 文庫的單個細菌克隆制備
2. 在一個熱循環儀中，94°C 將混合物預熱 20s。
3. 按下面的參數進行 30 輪 PCR 循環。
94°C10s
55°C10s(或用引物的合適退火溫度）
72°C15s
將最后一個循環的延伸時間延長至 30s。
4. 冷卻至 4°C。
5. 取 25ul 的各反應產物，跑 4% 的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色分析（Sam-brook and Russell 2001)
三、分析
在圖 26-4 所示的例子中，用 12 個核苷酸的隨機文庫混合物作為模板，分析 PCR 產物顯示，
文庫的大部分都含有正確大小的插入（圖 26-4，第 2 泳道）。而且，檢測不到與原始載體對應的 PCR 產物（比較圖 26-4 第 1 泳道和第 2 泳道）。用 PCR 分析隨機選擇的文庫中的單個克隆，證實絕大部分插入片段大小是正確的，而且文庫中沒有原始載體的污染（圖 26-4，第 3~20 泳道）。分析 DNA 的序列證實，這些 PCR 產物正是 12 個核苷酸隨機文庫的正確成員（數據沒有列出）。因此，對反應中間產物（方案 2 圖 26-3) 進行 PCR 分析后估計，已經獲得了高質量的最終文庫（圖 26-4)。