用dUTP凈化PCR產物的實驗

dNTP 溶液  MgCl2 溶液 PCR 緩沖液 引物 尿嘧啶-DNA-糖基酶 Taq DNA 聚合酶

PCR 儀 離心管

一、材料

1. 試劑

（1）dNTP溶液（含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，每種濃度10 mmol/L)多數情況下，直接替換dUTP就可以了（RySandPersingl993;Koxetal.1994)。如果必要的話，為了補償對聚合酶的抑制作用，dUTP終濃度可提高到 0.6~1 mmol/L(Wangetal.1992;Hohlfeldetal.1994)。

（2）MgCl₂溶液，50 mmol/L

多數情況下Mg²⁺終濃度達到1.5 mmol/L就足夠了，然而應根據核苷酸（如dUTP)濃度和引物特異性適當優化。提高核苷酸濃度同時應提高Mg²⁺濃度。

（3）PCR緩沖液，10X(100 mmol/LTris-HCl , pH8.4,500 mmol/L KCl ）

2. 引物

正向引物（l0umol/L)

反向引物（l0umol/L)

3. 酶

（1）尿嘧啶-DNA-糖基酶，1U/ul（Invitrogen)

1UUDG 可以去除 5ng 污染物，根據要求的凈化程度可以減少到0.01 活性 U(KoxetaL1994)B（2）Taq DNA 聚合酶 5U/ul

熱啟動 Platinum7'叫 DNA 聚合酶 Invitrogen10966-018) 允許在室溫條件下準備 PCR 反應液。

4. 設備

可以設定程序（注意在「二、方法」中的（3）和（4）有修改）的 PCR 儀、PCR 擴增用薄壁離心管。

二、方法

（1）在滅菌的離心管中于冰上加入下列試劑。

10 x PCR 緩沖液                  5ul

dNTP 溶液                            1 ul
注：dNTP 溶液，含有 dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP, 每種濃度 10 mmol/L

正向引物、反向引物             1 ul（每種 l0umol/L）尿嘧啶-DNA-糖苷酶 1U/ul       1U

TagDNA 聚合酶（5U/ul）      0.5ul

MgCl₂(50 mmol/L)                 1.5ul

H₂0                                         40ul

（2）37°C 溫育 l0min。

這一步 UDG 可以從污染物中去除屎嘧啶殘基。據報道這一凈化過程也可以在室溫條件下完成（dcWitetal.1993；Wangetal.1992).

（3）94°C 加熱 l0min, 失活 UDG 并水解污染的 DNA(Hohlfeldetal.1994;Koxetal.1994)。

（4）在標準 PCR 基礎上增加 2 個循環。

增加 2 個循環可以補償 dUTP 對擴增效率的影響（Longoetal.1990)。

（5）在 PCR 結束之前，將溫度保持在 72°C, 直至儲存。

據報道，PCR 結束后如果降低溫度，大腸埃希菌 UDG 會恢復一小部分催化活性。

（6）把含尿嘧啶 DNA 以及含有 UDG 活性的反應混合物 -20°C保存。