試劑、試劑盒 dNTP 溶液 MgCl2 溶液PCR 緩沖液引物尿嘧啶-DNA-糖基酶 Taq DNA 聚合酶
儀器、耗材 PCR 儀離心管
實驗步驟
一、材料
1. 試劑
（1）dNTP溶液（含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，每種濃度10 mmol/L)多數情況下，直接替換dUTP就可以了（RySandPersingl993;Koxetal.1994)。如果必要的話，為了補償對聚合酶的抑制作用，dUTP終濃度可提高到 0.6~1 mmol/L(Wangetal.1992;Hohlfeldetal.1994)。
（2）MgCl2溶液，50 mmol/L
多數情況下Mg2+終濃度達到1.5 mmol/L就足夠了，然而應根據核苷酸（如dUTP)濃度和引物特異性適當優化。提高核苷酸濃度同時應提高Mg2+濃度。
（3）PCR緩沖液，10X(100 mmol/LTris-HCl , pH8.4,500 mmol/L KCl ）
2. 引物
正向引物（l0umol/L)
反向引物（l0umol/L)
3. 酶
（1）尿嘧啶-DNA-糖基酶，1U/ul（Invitrogen)
1UUDG 可以去除 5ng 污染物，根據要求的凈化程度可以減少到0.01 活性 U(KoxetaL1994)B（2）Taq DNA 聚合酶 5U/ul
熱啟動 Platinum7'叫 DNA 聚合酶 Invitrogen10966-018) 允許在室溫條件下準備 PCR 反應液。
4. 設備
可以設定程序（注意在「二、方法」中的（3）和（4）有修改）的 PCR 儀、PCR 擴增用薄壁離心管。
二、方法
（1）在滅菌的離心管中于冰上加入下列試劑。
10 x PCR 緩沖液 5ul
dNTP 溶液 1 ul
注：dNTP 溶液，含有 dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP, 每種濃度 10 mmol/L
正向引物、反向引物 1 ul（每種 l0umol/L）尿嘧啶-DNA-糖苷酶 1U/ul 1U
TagDNA 聚合酶（5U/ul） 0.5ul
MgCl2(50 mmol/L) 1.5ul
H20 40ul
（2）37°C 溫育 l0min。
這一步 UDG 可以從污染物中去除屎嘧啶殘基。據報道這一凈化過程也可以在室溫條件下完成（dcWitetal.1993；Wangetal.1992).
（3）94°C 加熱 l0min, 失活 UDG 并水解污染的 DNA(Hohlfeldetal.1994;Koxetal.1994)。
（4）在標準 PCR 基礎上增加 2 個循環。
增加 2 個循環可以補償 dUTP 對擴增效率的影響（Longoetal.1990)。
（5）在 PCR 結束之前，將溫度保持在 72°C, 直至儲存。
據報道，PCR 結束后如果降低溫度，大腸埃希菌 UDG 會恢復一小部分催化活性。
（6）把含尿嘧啶 DNA 以及含有 UDG 活性的反應混合物 -20°C保存。