實驗方法原理 溶解蛋白質,與染料混勻,l0min 后閱讀 O.D.。
實驗步驟
材料
十二烷基硫酸鈉(SLS,SDS),水溶 3.5 mmol/L 或 0.3mol/L NaOH。考馬斯亮藍 G-250, 0.12 mmol/L(0.01%),溶于 4.7 % 乙醇和 85 % (W/V ) 磷酸:將 100 mg 考馬斯藍溶于 50 ml 95% 乙醇,加人 100 ml 85% 磷酸;然后以 1L 水稀釋。
蛋白質標準溶液(如 BSAlOpg/ml);設計實驗,然后間隔 1~2 個月,以 BSA 或相似的標準蛋白質(1 50ug/ml) 制作標準曲線。
操作步驟
1. 將蛋內質(1~20ug)或細胞(約 1X106) 溶于 100ul3.5 mmol/L SLS 或 0.3mol/L NaOH 中。
2. 分別加人 100ul 試劑空白對照(SLS),100ul 受測蛋白質溶液,lOOul BSA 標準品,每個 3 管。
3. 加人 lml 考馬斯藍。混勻溶液,靜置 10 min。
4. 在分光光度計 595nm 處,以試劑空白作對照,閱讀受測管如 BSA 標準數字。
提示
Bradford 法的試劑可以從 Bio - Rad 購得試劑盒。試劑盒中的磺基羅丹明(Sulforhodamine B)
[Skehanetal, 1990 ] 和試劑 N -二(羥乙基)甘氨酸 (BCA ) [Smith et al., 1 9 8 5 ]
都可用于測定蛋白質的含量并且對微量滴定實驗敏感度很高。Micro -BCA 試劑盒可從 Piece (見附錄 ID )
得到。這些試劑很靈敏,適用于少量細胞(約 1X103) 的檢測。