用CRISPR／cas9編輯精原細胞基因

　　利用CRISPR/Cas9 系統對胚胎進行基因編輯，可有效地產生具有靶向基因組修飾的生物體。三月十二日在Cell子刊《Cell Reports》發表的一項研究中，來自德克薩斯大學西南醫學中心、芝加哥大學和猶他大學等處的研究人員，用CRISPR / cas9技術對大鼠的精原細胞進行基因編輯，為在大鼠中產生靶向胚系突變以及研究精子發生，提供了一個平臺。

　　CRISPR/cas9 RNA引導的DNA內切酶技術被廣泛用來在不同類型細胞和生物體中生成靶向基因突變，以研究它們的生物學過程。在哺乳動物中，用CRISPR / cas9進行的基因編輯，在嚙齒類動物、豬、山羊和猴子中產生了高比率的供體-胚胎衍生后代，它們都具有靶向基因突變。向小鼠注射表達gRNAs和 cas9（可直接裂解供體受精卵中的靶向基因序列）的結構后不到一個月，就可以產生變異的小鼠。CRISPR /cas9非常有效，在通過共注射具有gRNAs的受精卵而產生的動物中，多個靶基因的兩個等位基因都被破壞。

　　CRISPR/cas9在動物中也能有效地促進靶等位基因鑲嵌性，這表明，隨著全能性受精卵經歷胚胎植入前的發育，早期胚胎卵裂階段發生了獨立的基因編輯活動。CRISPR/cas9通常在胎齡（E）0.5天到E1被傳遞到哺乳動物受精卵。例如，在E6到E6.5之間，小鼠生殖細胞分化成一小部分外胚層細胞（10到20個近端外胚層細胞）。

　　這就解釋了為什么在第一代突變體動物組織中觀察到CRISPR / cas9靶等位基因鑲嵌性，為什么身體組織中的靶等位基因不同于生殖細胞。鑲嵌體動物中的靶等位基因異質性必須通過遠交才會產生純的、無鑲嵌性的種系突變基因。通過實驗性地遠交等位基因鑲嵌體來挑選新的突變，在嚙齒類動物中需要花幾個月，在一些物種中，由于更長的生命周期和/或低繁殖力，還需要更長的時間。

　　當宿主胚胎是用CRISPR / cas9轉基因多能干細胞重建時，也會產生靶等位基因鑲嵌性。正如早期胚胎，CRISPR / cas9可能明顯地修改干細胞克隆中的多個靶基因（當細胞分裂時）。除了這種變化，用多能性供體細胞重建的野生型囊胚，可進一步產生“鑲嵌性”動物，它們的器官系統和生殖細胞是由供體和受體胚胎細胞混合物發育而來。

　　當把CRISPR / cas9修改的無性系富集供體細胞，通過體細胞核移植到無核卵母細胞中，從而產生豬和羊的時候，鑲嵌和嵌合現象大幅減少。用預篩選重建四倍體胚胎，也可以預測無性繁殖擴增的多能細胞系，以最小化外胚層來源組織中的鑲嵌性和嵌合性。或者，直接在供體精子發生干細胞中編輯生殖細胞，可避免胚胎發育的全能性和多能性狀態，從而消除了鑲嵌/嵌合突變體后代的生產。

　　在這項研究中，為了促進大鼠的生殖細胞編輯，研究人員使用CRISPR/Cas9來促進大鼠培養精原干細胞中的靶向基因組突變。CRISPR /Cas9修改的精原細胞可再生精子發生，并在移植到大鼠睪丸之后表現出長期的精子形成潛力。Epsti1和Erbb3中的靶向生殖系突變，被垂直地從受體進行傳遞，僅產生純的、無嵌合性的突變后代。產生的Epsti1突變大鼠，沒有或者有供體精原細胞的遺傳選擇。Erbb3無效種系的單克隆富集，揭露了培養細胞中的隱性精子形成存在缺陷，產生了靶等位基因同基因型的突變后代。

　　總而言之，用CRISPR / cas9進行的精原細胞基因編輯，為在大鼠中產生靶向胚系突變以及研究精子發生，提供了一個平臺。