用QExactive篩查未知非法添加劑三聚氰胺事件不再重演

　　【導語】三聚氰胺、塑化劑等食品安全事件，給我們帶來啟示：人為添加的有機非法添加劑，比農/獸藥殘留的危害要大得多。為什么？因為這些是不法分子為躲避現有標準檢測方法設計出的添加物，比如不許食用的廉價工業原料，但這類非法添加劑對食品企業和檢測機構來說是未知物。

　　這里不探討法律/社會/道德層面的問題，單純從技術的可操作性上來說，目前我們缺少檢測未知有機污染物的有效手段，這個有效性是指：要有方法可以從幾千萬的有機物中篩選出，樣品里到底加了什么？并且這個檢測方法必須要足夠簡單。

　　西安質譜年會期間，分析測試百科網記者采訪了賽默飛世爾科技色譜質譜部高級應用專家James Chang博士和中國市場部經理王勇為博士，他們介紹了一個有可能解決上述問題的、非常驚人的技術——Q Exactive臺式FT軌道阱質譜儀，這里記錄下來，希望給各位讀者帶來啟示……

　　

　　賽默飛世爾科技色譜質譜部高級應用專家James Chang博士（左）和中國市場部經理王勇為博士（右）

　　驚人實例：食品中完全未知的化合物檢測

　　James博士首先表示：“當前食品安全領域面臨的一個最大挑戰是：污染成分和非法添加物不斷出現；人們在擔憂，下一個三聚氰胺和塑化劑何時出現？”賽默飛世爾科技在今年6月的ASMS上推出Q-Exactive質譜儀，提出了一種Quanfirmation的流程，可以同時進行化合物的鑒定、定量和確證。“在食品安全檢測中，Q-Exactive被證明的突出能力是簡單、快速、可靠。”

　　

　　James博士隨后給了兩個例子，很讓人吃驚。

　　美國某食品檢驗部門，送來一些橘子皮讓James檢測里面可能的危害成分，James在第一時間給出了答案——檢測到橘子皮中的Imazalil（烯菌靈），Carbendazim（多菌靈），和Thiabendazole（噻菌靈），該部門非常滿意。

　　美國一家知名的食品廠商，總是擔心采購的原料的安全。有一次，他們給James送了5份面筋樣品，希望看看是否合格。使用Q-Exactive，James很快檢測到其中兩份中含有三聚氰胺，這個結果讓客戶非常滿意（這兩份是客戶自己摻進去的三聚氰胺），對采購的原料更有信心，也很快在他們的實驗室配置了Q-Exactive。

　　分析3S：Selectivity選擇性、Sensitivity靈敏度、Speed速度

　　在復雜基質中的樣品分析（如食品安全、蛋白質組、代謝物分析）中，樣品往往比干擾的各種基質濃度低得多，這時分析工作需解決的主要問題是去除干擾，即提高分析方法的選擇性。因此，在通常所說分析的3個“S”中，先要考察Q-Exactive的選擇性。

　　Selectivity選擇性：

　　分辨率>50,000 時，HRMS的選擇性大于MS/MS，可直接用HRMS來定性和定量

　　Q-Exactive是一個四極桿Q+一個Orbitrap，看起來跟Q-TOF類儀器比較相像：都是一個四極桿加上一個高分辨率的質量分析器。當問道James怎么來比較Q-Exactive和Q-TOF時，他表示，

　　“從分辨率的角度來看，Q-Exactive更具優勢，前者只能達到40,000~60,000 FWHM，而后者可達140,000 FWHM。

　　從質量測定的準確度上看，Q-Exactive是傅立葉變換質譜Orbitrap，利用頻率來檢測m/z，不依賴于離子的初始化能量，它能夠確保色譜峰上每次掃描質量都非常精確；而Q-TOF利用飛行時間來檢測m/z，在色譜峰的前、中、后測定的質量不完全一致，總會存在能量色散，所以Q-TOF采用多個掃描做平均的方式（即RMS）來得到精確質量數。”

　　

　　4種100ppb的農藥，在4種不同的分辨率下的分離情況對比

　　James接著說，“有人會問：為什么需要這么高的分辨率？我為此做了大量的實驗，總結來看：分辨率應>50,000 FWHM，跨過一個色譜峰的每次掃描都能獲得精確質量（不是RMS平均的），才能有效地區分復雜基質中待分析的化合物，見圖例，分離100ppb下4種農藥，只有分辨率達到50,000以上時才可分開這4種農藥。”　

化合物	化學式	真實質量
Isozophos	C9H17ClN3O3PS	314.04895
Isoxathion	C13H16NO4PS	314.06104
Triazophos	C12H16N3O3PS	314.07225
Hexaconazole	C14H17Cl2N3O	314.08214

 

　　佐證：

　　事實上，A.Kourfman等已發表論文（Anal Chim Acta. 2010 Jul 12；673(1):60-72. Epub 2010 Jun 3., Comprehensive comparison of liquid chromatography selectivity as provided by two types of liquid chromatography detectors (high resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry): "where is the crossover point?".），論證比較了質譜的HR/AM（高分辨/精確質量數）和MS/MS的選擇性。文中指出，當分辨率大于50,000后，HR/AM的選擇性大于MS/MS（三重四極桿常用的方法）。即：當分辨率達到50,000以上時，用一級質譜HRMS，已經具有比MS/MS更高的選擇性，可以直接用HRMS來定性和定量。（所以，根本就不再需要優化MS/MS的碰撞能了！）

　　HCD實現的MS/MS：增加的確認（Confirmation）能力

　　在Q-Exactive上，可用HCD實現MS/MS。據James介紹，在食品安全的應用上，Exactive的HR/AM選擇性已經足夠高了，但EU確證農/獸藥殘留的方法要求4分，僅有HR/AM得2分，所以Q-Exactive增加了MS/MS功能，獲得全掃描MS/MS譜，就可以確證化合物了。

　　參考：歐盟關于質譜分析方法鑒定點數的出處

　　Q-Exactive上的MS/MS是通過HCD高能碰撞解離的功能實現的。記者看到HCD碰撞池在C-Trap之后，按通常的理解HCD應在四極桿之后、C-Trap之前，感到有些奇怪，James說“若選擇做MS/MS，離子在HCD經碰撞分裂后又被送回C-Trap中，表面看來非常新奇，其實只需用電壓控制就能快速實現離子的流動，所以空間上HCD池放在C-Trap之前或之后都是一樣的。”

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　　Sensitivity：提高靈敏度，高分辨下可以保持高靈敏度

　　靈敏度也是食品安全及其它應用關心的問題，針對記者提出的“Orbitrap為什么在高分辨時還具有高靈敏度？”的問題，James博士回答說，“Orbitrap的體積很小，僅有2寸大小；真空度高達2×10^-10， 離子在里面處于近乎理想的狀態在來回振蕩，在這么小的范圍，超高真空的高頻率振蕩下，損失非常小，可以保持靈敏度。另外，Q-Exactive采用新型 S-lens離子傳輸光路，和以前的tube lens相比最大的不同在于，S-lens是電壓（DC）+射頻（RF），而tube lens只有電壓，S-lens提高了5倍的離子傳輸效率。”

　　“ThermoFisher上海演示中心已經安裝了Q-Exactive，我們的應用工程師做了19種β-激動劑的定性定量，LOQ低至5 ppt，定量的曲線和RSD都非常好。”

　　

　　用Q-Exactive同時對19種β-激動劑（如：瘦肉精、沙丁胺醇等）定性定量，上圖是5ppt濃度下的每種β-激動劑的高分辨率質量的提取色譜圖

　　

　　19種β-激動劑的定量結果

　　Speed：速度和通量

　 　針對記者提出的“有人說，Q-TOF和QQQ的速度更高，而Orbitrap速度低”的說法，James表示，“對于僅做目標物定量的實驗室，QQQ由 于采用MRM模式，可得到高通量，但在一定時間內的目標物數量仍有限，且建立方法費時。Q-Exactive采用超高分辨模式，在有限時間內的目標物數量是無限的，且不需對每個目標物逐一優化參數，因此Q-Exactive實際上更快更簡單。比如，美國某機構做幾百種農殘測定的方法，用QQQ建方法要三個月，用Q-Exactive建方法縮短到只需一天，就把所有目標物的定量全部做完。對Q-Exactive而言，大大簡化了儀器方法的開發！

　 　而對于非目標物、未知物的定性定量，QQQ不能提供有效數據。由于分辨率原因，Q-TOF的HRMS模式定量在可靠性和靈敏度上仍受到一定限制，一般仍采用MS/MS來定量，在優化方法時花費較長的時間。對比來看，Q-Exactive用HRMS來做定性和定量，用MS/MS來做確證，靈敏度高，線性范圍寬，是最快的儀器！”

　　另外，Q-Exactive還具有譜圖疊加功能（Spectrum Multiplexing）， 能夠更好改善信噪比，并提高分析速度。實現方法為：四極桿Q選擇離子，送入C-Trap保存，在1秒鐘內C-Trap最多可富集保存100個不同的離子， 然后將這些離子一同送入Orbitrap做高分辨率的SIM。這樣既提高了靈敏度，又根據四極桿做SIM比Orbitrap快的特點來充分利用了等待時間，提高整體分析速度。

　　Quanfirmation流程：鑒定、定量和確證　　

有機污染物的三種篩查

　　Q-Exactive推出，提出新的“Quanfirmation”工作流程，即可對化合物進行鑒定、定量和確證；在有機污染物的篩查實驗中，需要同時實現定性和定量。

　　這類篩查方法可分為三種，已知-已知、已知-未知、未知-未知。下面分別描述Q-Exactive如何實現的。

　　（1）已知-已知（Known Known）篩查

　 　這是我們最常見到的目標物篩查（Target Screening）法。以前常用三重四極桿（QQQ）來實現這類篩查。建立方法時，每一個標準品都建立至少兩對MRM，然后編成一個方法，用于實際樣品 的篩查。對于幾個到幾十個化合物，建立方法相對容易；但對于幾百甚至上千的化合物，建立方法常要花費幾周到幾個月的時間，而且，今后在方法中再增加新的待 檢化合物時會遇上麻煩——有可能要重新建立方法。

　　使用Q-Exactive建立方法非常簡單：質譜方法：把所有要監測的目標物的母離子 精確質量，正/負離子化極性，輸入列表（inclusion list），當系統進行全掃描時，會自動檢測到同列表內母離子質量的差別在10 ppm的離子，自動做MS/MS（dd-MS²）得到結構并進行化合物確認，而定量分析是用HRMS。色譜方法：只需使用一根普通的HPLC色譜柱，一個常用的色譜條件，即開始運行實驗。運行完畢，如果一切都比較理想（比如化合物正常從色譜上流出，LOQ滿足要求），就可以直接保存這個成功建立的方法了。

　　實踐證明，用Q-Exactive，開發方法時間只需幾個小時（QQQ大概要幾周到幾個月的時間）。 舉例中，James建立一個12分鐘的實驗方法，可同時篩查510種農藥殘留，靈敏度到ppb級。James強調說，“HPLC在這里的主要工作是把樣品 稍微分一下，減少一些離子抑制，一根柱子、一個方法就足以；后面的定性定量靠的都是Q-Exactive的HRMS。”按2002/657/EC指令，1 個HRMS得2分，1個HR MS/MS離子是2.5分，事實上Q-Exactive常可獲得多個HR MS/MS，所以得分遠遠大于4分的化合物識別要求。

　　更神奇的是，由于Q-Exactive靈敏度很高、主要依靠HRMS的選擇性，所以可進一步減少前處理，比如：把樣品1:1液液提取（LLE），然后離心過濾，再進行100倍的稀釋（稀釋能有效降低基質效應），然后進樣分析，同樣可以達到10 ppb的檢出限要求。

 不必前處理，稀釋后直接分析

　　

　　參考：　　用Exactive快速篩查510種農藥

　　（2）已知-未知（Known Unkown）篩查

　 　它是Non-target screening非目標物篩查的一種，和目標物篩查的區別是：分析者雖然知道要測的化合物是哪一類（比如農藥殘留、法醫用的毒物毒品等），但不知道具體 要監測哪些物質，比如農藥有幾千種，具體監測哪些不清楚。這時，可以把懷疑的任何一種化合物的分子式輸入列表，還可以借助已包含3,000多種化合物的精確質量的ExactFinder軟件，如果需要推斷代謝物的結構，可借助Mass Frontier軟件來推斷碎裂的機理。

　　（3）未知-未知（Unkown Unkown）篩查

　 　它是Non-target screening非目標物篩查的一種，以前用別的方法和儀器做不了；因為自然界有機物有幾千萬種，針對一個懷疑有非法添加物的樣品，完全不知道應該查什 么。現在由Q-Exactive，配合SIEVE軟件，再有一個空白做對照的Control樣，就可以進行篩查了。

　　方法是：為使統計學上有意義，每個樣品至少做三次，用SIEVE軟件先將樣品和Control樣的譜圖對齊（Alignment），然后自動分成許多（如：980,000 個）小方塊，再去比較每一個小方塊里樣品和Control樣的差異，如果樣品里有某個m/z，而Control樣里沒有這個m/z，就可以找到顯著的差 異；再用PCA主成份分析法來分析這種找到的差異，判斷其在統計上是不是可靠的。James舉了許多篩查非法添加物或摻假化合物的實例。

　　注：SIEVE軟件本來是Thermo Scientific為蛋白質組學和代謝組學設計的軟件。

　　

　　完全未知化合物的篩查和確認

　　Q-Exactive：滿足食品安全檢測實驗室現在和將來的需求

　 　據了解，目前，Q-Exactive已經被美國各個食品安全檢測實驗室運用到篩查試驗中。王勇為經理總結道，“Q-Exactive具有高分辨率、高靈 敏度、高穩定性、高通量、動態范圍寬等特性，非常適合于應對食品安全不斷出現的新挑戰。它為食品企業、食品檢測機構等提供了一種新的選擇，既可以做原來三 重四極桿上實現的目標物定量和篩查方法，也可以滿足實驗室未來面臨的非目標物篩查的需求——如完全未知物的檢測”。

　　“我們相信，Q-Exactive將大大地改變原先食品安全實驗室的工作流程。”

　　Q-Exactive：初級實驗員培訓數小時，就能完成幾百種化合物的定性定量

　 　James補充說，“Q-Exactive用HRMS來定量，具有非常高的分辨率和靈敏度，它使原來極其復雜的試驗變得特別簡單：不需要反復優化色譜條 件、不需要反復優化碰撞能、不需要復雜的前處理。對一個完全不懂液質聯用的生手來說，Q-Exactvie可以讓他/她在幾個小時內學會成百上千種化合物 的定性、定量和確證。”

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Q Exactive臺式FT 軌 道 阱 質 譜 儀