小分子干擾RNA (Small interfering RNA ，siRNA )
是一種非常有效的工具，能夠在包括哺乳動物細胞在內的多個體系中抑制特定基因的表達，從而研究某個基因的功能或者是相關信息。但是這種強有力的方法的難題之一是需要設計，合成siRNA
s 和驗證其效果，從而找到最有效的siRNA s 。這個過程需要花費相當的時間和經費。以化學法合成基因特異的siRNA s
為例，由于設計好的siRNA s 中通常只有大約25% 的siRNA s 能高效抑制基因的表達（抑制效率>80%
），這使得化學合成siRNA 的成本升高。體外轉錄制備長片斷RNA 并不難，但是由于研究表明長片斷的雙鏈RNA （>29bps
）在哺乳動物細胞中通常會引發抗病毒反應―― 一種非特異基因表達抑制，而目前體外轉錄往往無法制備小于29bp 的小分子siRNA s
。一個新的研究發現，用RNase III 降解長片斷雙鏈RNA 成為siRNA s
庫也能夠有效誘導特異的基因沉默，這樣可以避免了篩選有效siRNA s 的漫長過程，從而快速，經濟的實現特定基因表達的沉默。
在線蟲、果蠅和其他一些物種的RNA 干擾(RNA interference ，RNA i) 通路中，長片斷的雙鏈RNA
進入細胞后會被一個類似RNase III 的內切核糖核酸酶(Dicer) 降解為一系列的21―23bp
長度，3’端有兩個堿基突出（帶羥基）5’磷酸化的siRNA s 。這些siRNA s 介導同源轉錄本的降解，從而導致基因表達沉默。( 1-5)
大腸桿菌Escherichia coli RNase III 參與多種細菌RNA s，噬菌體甚至是質粒來源的RNA s 降解(6-9)
，能夠將長片斷的雙鏈RNA s降解為一系列12―15bp 的短雙鏈RNA s，產物末端結構類似Dicer 降解產物(9) ，通過改變RNA
seIII
的酶切條件可以提高降解產物的平均長度，達到目前的21bp。這些21bp的降解產物能夠有效介導在哺乳動物細胞和小鼠胚胎中特定基因的RNA
i(10,11) 。另外，實驗表明，RNase III
的完全降解產物（12―15bp）同樣可以誘導專一的基因沉默，效果與化學合成或者是酶法得到的siRNA s 相當。
驗證RNaseIII 的消化能力
采用RNaseIII 分別消化體外轉錄制備的人源GAPDH ，La 和c-FOS(200 bp) 雙鏈RNA ，從而驗證RNaseIII
的消化能力，結果表明，1個單位的RnaseIII 在37度1小時可以將1mg 的雙鏈RNA 降解為30bp以下，主要是12―15bp
的siRNA s 混合物。用其他基因的雙鏈RNA ，同樣證實RNaseIII 能夠消化各種雙鏈RNA 序列。另外用Cyclophillin,
c-myc, Map Kinase 9, PKC-alpha, Raf-1, Nautilus, 和 h-ras 等基因的雙鏈RNA 作為
RNase III 底物，也可以得到同樣的結果。這表明 RNase III 能夠消化各種來源的雙鏈RNA 。
驗證 RNaseIII 降解產物誘導基因沉默的能力
GAPDH 和La 在Hela細胞中的豐度高，也比較容易檢測內源基因的表達水平。將RNaseIII降解GAPDH 和La 得到的siRNA s
庫轉入Hela 細胞，用免疫熒光法檢測其誘導基因沉默的能力。根據所檢測的細胞數量對熒光信號進行平衡化和定量。但是內源的c-FOS
在293細胞中的豐度較低，表達水平下調后就難以檢測，為了做同樣的驗證，實驗采用50nM 佛波脂 phorbol ester (PMA)
提前24小時誘導處理使c-FOS 表達水平升高。用由RNase III 消化c-FOS 雙鏈RNA 得到的siRNA s
混合物轉染293細胞，用同樣方法檢測對基因表達的抑制效果。結果顯示用RNase III 消化各種雙鏈RNA 得到的siRNA
庫對相應的基因表達抑制效果分別是：GAPDH 表達水平下調78% ，La 表達水平下調86% ，而c-FOS 表達水平則下調75%
。這個結果表明RNase III 得到的siRNA s 庫能夠非常有效的抑制基因的表達。