用ReadyMixTMPCRReactionMix進行擬南芥SSLP

用ReadyMix TM PCR Reaction Mix 進行擬南芥SSLP （32 個樣品+3 個對照）

一、PCR

采用SIGMA REDTaq? ReadyMixTM PCR Reaction Mix提供的 試劑 （包括20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.002% gelatin, 0.4 M dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), stabilizers, 0.06 unit/μl Taq DNA Polymerase）。

用CER456772 SSLP Marker, Col 348 bp, Ler 291 bp. All primer stocks: 100 μM. 90 μl H2O + 10 μl primer stocks = 10 μM primer.

32 Samples + 2 Col DNA + 2 Ler DNA + 2 F1 (Col×Ler) DNA: 38 PCR Reactions.

PCR每一管中應加入：

2 μl DNA Template

2 μl H ₂ O

0.5 μl CER456772 Forward primer 10 μM

0.5 μl CER456772 Reverse primer 10 μM

5 μl ReadyMixTM PCR Reaction Mix

共10 μl

PCR條件（保存為BOBBY）：

94℃, 4 min。94℃, 15 s；55℃, 15 s；72℃, 30 s。循環40次（調PCR儀時調39次）。

另外，有人喜歡72℃, 3 min。可不用。

1、吸取Sample（DNA Template）2 μl到新的PCR管中，然后將除DNA Template 外的上述溶液混合配成Premix，意味著每一管中加入8 μl Premix。對C、LER、F1及32個Sample進行PCR，Premix總共應配40 ×8 μl = 320 μl（為保險起見，多配2封16 μl），即在一新的大管中加入如下溶液混合：

2 μl × 40 = 80 μl H2O

0.5 μl × 40 = 20 μl CER456772 Forward primer 10 μM

0.5 μl × 40 = 20 μl CER456772 Reverse primer 10 μM

5 μl × 40 = 200 μl ReadyMixTM PCR Reaction Mix

注意Primer Stcoks濃度為100 μM，用前可稀釋。混合前后應進行振搖和離心（到達6000 rpm）。

2、在已放入Sample（DNA Template）和對照2 μl到新的PCR管中各加入8 μl Premix，反復抽吸混勻。然后進行PCR反應。

二、DNA電泳

DNA電泳槽中號為120 ml。通常跑100 bp-200 bp（多或少10 bp-20 bp）長DNA用瓊脂糖濃度為3-4%的膠，200 bp-400 bp長DNA用瓊脂糖濃度為2.5%的膠。2.5%意味著2.5 g/100 ml。用DNA中號電泳槽所需瓊脂糖為120 ml ×2.5% = 3 g。

100 bp DNA Ladder可確定100-1500 bp長的雙鏈DNA。

1、首先稱量3 g瓊脂糖，然后加120 ml 0.5×TBE緩沖液，稱量其重量。

2、用微波爐加熱融化，直至看不到瓊脂糖顆粒，然后再稱重，加水至原加熱前重量。

3、用膠布構建倒膠槽，在融化的瓊脂糖溶液中加5 μl SYBR SAFETM DNA gel stain，混勻。

4、待瓊脂糖冷至60℃后，倒入制膠槽，讓其在室溫下冷卻。

5、除去膠布，將制膠槽放入電泳槽，加0.5×TBE緩沖液至淹沒瓊脂糖凝膠，高于膠面1 cm。

6、取DNA Ladder（6 μl）及經PCR擴增的對照和樣品（10 μl）點樣。中型 電泳儀 將電壓調整到100 V，開始電泳。

7、約45-60 min后，關閉 電泳儀 。取膠槽拍照，記錄。