試劑、試劑盒 乙腈碳酸氫銨TE 溶液放射性標記寡核苷酸
儀器、耗材 離心干燥機微量離心管放于管架或收集器Sep-Pak 經典層析柱注射器
實驗步驟
材料
溶液和緩沖液
稀釋貯存液至適當濃度。
乙腈（5%、30% 和 100%)
毎個 Sep-Pak C18 柱用 10 ml 髙效液相（HPLC) 級乙腈（100%), 使用前用水稀釋乙腈。
碳酸氫銨（25 mmol/L,pH8.0)
含 5%(WV) 乙腈的碳酸氫銨（25 mmol/L，pH8.0)
將 5 ml 乙腈與 95 ml25 mmol/L 碳酸氫銨混合
TE 溶液（pH7.6）
核酸與寡核苷酸
放射性標記寡核苷酸
用于純化的原料是方案 2(步驟 3 或步驟 5）的反應混含液，并已在 68°C 加熱滅活噬菌體 T4 多核苷酸
專用設備
離心干燥機（Savant Speed Vac 或相應儀器)
微量離心管（1.5 ml) 放于管架或收集器
用于收集層析柱純化的放射性標記寡核苷酸洗脫液
Sep-Pak 經典層析柱，短柱身
毎一 Sep-PBk 經典層析柱（可從 Millipore 公司的 Waters 部門購買）含有 360 mg 疏水反相層析樹脂（C18）。純化是利用寡核苷酸在溶劑（水溶液）極性較大時與樹脂結合，而在熔劑（如甲醇與水混合液) 極性較小時脫落的原理。每一次磷酸化反應需要一個分離柱。
注射器（10 ml 聚丙烯注射器）
方法
1.Sep-Pak Cl8 反相層析柱準備如下：
a. 將裝有 10 ml 乙腈的聚丙烯注射器連接于 Sep-PakC18 經典層析柱。
b. 用注射器緩慢沖洗層析柱。
c. 先將注射器與層析柱分離，再將注射器的柱芯抽出注射器針簡，這樣可以防止空氣抽入層析柱內。將注射器針筒再連于層析柱上。
d. 用 10 ml 過濾無菌水洗去有機溶劑，共 2 次，每次沖洗后均重復步驟 c。
2. 用無菌水將放射性標記的寡核苷酸稀釋至 1.5 ml, 并將全部樣品用注射器推入層析柱。
3. 用下列四種溶液沖洗層析柱，每次沖洗后重復步驟 1c。
10 ml 25 mmol/L 碳酸氫銨（pH8.0)
10 ml 25 mmol/L 碳酸氧銨/5% 乙腈
10 ml 5% 乙腈
10 ml 5% 乙腈
4.3 份 lml30% 乙腈洗脫放射性標記的寡核苷酸，用 1.5 ml 微量離心管分別收集每個組分，每次洗脫后重復步驟 lc。
警惕：磷酸化反應常常使用大于 100uCi 的放射性標記 ATP, 因此這些層析組分的放射性劑量可能相當可觀。應小心、謹慎處理未摻入的放射性物質、移液器吸頭及微量離心管。
5. 用離心干燥機干燥含寡核苷酸的溶液（Savant SpeedVac 或相應儀器）。
6. 將放射性標記的寡核苷酸溶于小體積（10ul) 的 TE(pH7.6)。