簡介
在這篇應用文獻中，我們展示了如何用SpectraMax?i3、SpectraMax?Paradigm?和SpectraMax?M5e多功能微孔板讀板機進行可靠的、高通量的HTRF?檢測，并具有完美的Z’因子和高重復性的EC50值。
HTRF?是CisbioBioassays公司開發的一項檢測生物分子相互作用的多用途技術1。這項技術結合了熒光共振能量轉移(FRET)技術和時間分辨(TR)熒光測定，可消除短壽命的背景熒光。這一檢測使用供體和受體熒光基團。當供體和受體彼此足夠接近時，能量源(如氙閃燈)激發供體使能量轉移到受體上，受體發射出特定波長的熒光。
HTRF使用4種專門的熒光基團，能夠組合成一對供體-受體TR-FRET基團。供體為銪(Eu3+)的穴狀化合物和鋱(Lumi4TM-Tb)的穴狀化合物，其長壽命熒光可以用于時間分辨熒光檢測中1。兩種受體分別為XL665和d2，用于HTRF檢測中。這兩種受體的激發光譜均與HTRF供體的發射光譜重疊。每個受體的發射峰都在665nm且供體在這一范圍內沒有發射光或發射光很弱。最初的HTRF受體XL665，是一種從紅藻中純化出的藻膽蛋白色素。第二代受體d2是一種經過修飾的別藻藍蛋白，比XL665小100倍且可以減少可能在XL665檢測中出現的空間位阻問題。
HTRF cAMP HiRange試劑盒能夠在細胞樣品中對環腺苷酸(cAMP，環腺苷3’，5’ 一磷酸)進行定量。cAMP在G蛋白偶聯受體(GPCR)信號轉導中是一種關鍵的第二信使。當配體結合到GPCR，構想改變就會發生，激活受體接著激活G蛋白。進一步的信號轉導取決于激活的G蛋白類型。Gs的激活導致腺苷酸環化酶調控cAMP的上調。細胞中產生的自由cAMP與d2-標記的cAMP競爭性結合抗cAMP穴狀化合物抗體，因此，細胞內cAMP的增加會導致FRET降低，偵測到的665nm熒光發射也會下降(圖 1)。
優勢
- 高度可靠的均相實驗
- Z’ 因子 ≥ 0.9
- 流程式且穩定的高通量(HTS)檢測
- SoftMax Pro軟件預設實驗模板快速獲得結果
材料
- cAMP HiRange 1000 測試
(Cisbio P/N 62AM6PEB)
- 黑色和白色低體積384-孔微孔板
(Greiner P/N 784076 和 784075)
- SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機
(Molecular Devices)
- SpectraMax Paradigm 多功能微孔板
讀板機(Molecular Devices)
- SpectraMax M5e 多功能微孔板讀板機
(Molecular Devices)
- HTRF 檢測卡盒
(Molecular Devices P/N 0200-7011)
方法
HTRF cAMP HiRange試劑盒由CisbioBioassays公司提供。按照cAMP HiRangeHTRF藥品說明書準備終濃度范圍從0.17nM到2800 nM的cAMP標準品。不含cAMP的陽性質控(最大FRET)和不含cAMP或cAMP-d2的陰性質控包含在內。按照表1中所述，每孔添加20 μL試劑。
數據分析
使用CisbioZL的基于雙發射波長檢測的比值算法分析HTRF檢測。616nm發射波長的供體作為內參，同時665nm發射波長的受體作為測定生物學反應的指示。這種比例測定減少了孔與孔之間的差異并降低了化合物干擾。在第4步計算的Delta F反映了測定時的信號相對于背景大小，用于內部測定的比較。結果通過665 nm/616 nm比值計算，以如下Delta F表示：
