由歧化作用測定的PDHC總活性實驗

酶樣品

磷酸鉀 MgCl2 丙酮酸 二磷酸硫胺 二硫赤蘚糖醇 輔酶 A NAD+ 磷酸轉乙酰酶 乳酸脫氫酶 羥胺 FeCl3 試劑

分光光度計

實驗所需「試劑」具體見「其他」

0.98 ml 實驗混合物

0.02 ml 酶樣品

30 ℃ 培養 15 min 后將樣品放于冰中，然后加入 0.2 ml 2 mol/L 羥胺。

室溫放置 10 min 后加入 0.6 ml FeCl₃ 試劑

離心 5 min，以緩沖液取代酶樣品為空白對照于 546 nm 測量吸收值。

計算

試劑：

0.1 mol/L 磷酸鉀，pH 7.6

0.1 mol/L MgCl₂（MgCl₂·6H₂O，Mr＝203.3；203 mg 溶于 10 ml 水中）

0.1 mol/L 丙酮酸（丙酮酸鈉，Mr＝110.0；110 mg 溶于 10 ml 水中）

0.01 mol/L 二磷酸硫胺（脫羧輔酶，Mr＝460.8；46.1 mg 溶于 10 ml 水中）

0.1 mol/L 二硫赤蘚糖醇（DTE，Mr＝154.2，或二硫蘇糖醇、DTT，Mr＝154.2；154 mg 溶于 10 ml 水中）

0.01 mol/L 輔酶 A（游離酸，Mr＝767.5，CoA·Li3，Mr＝785.4；23 mg 溶于 3 ml 水中）

0.1 mol/L NAD⁺（游離酸，Mr＝663.4；663 mg 溶于 10 ml 水中）

磷酸轉乙酰酶（4000 U/ml）

乳酸脫氫酶（10 000 U/ml）

2 mol/L 羥胺（等量的 4　mol/L 氯化羥胺，Mr＝69.49 和 4 mol/L KOH，Mr＝56.11 混合）

FeCl₃ 試劑

100 ml 5％ FeCl₃（8.33 g FeCl₃·6H₂O，Mr＝270.3，用 0.1 mol/L HCl 補充至 100 ml）

100 ml 12％ TCA（三氯乙酸，Mr＝163.4）

100 ml 3mol/L HCl（1：3 的比例混合 HCl 和 H₂O）

將三種溶液混合