由酶循環確定煙酰胺核苷酸實驗——?NAD（H）的測定

谷氨酸脫氫酶生成的 NAD^＋ 在 LDH 催化下轉化為 NADH，在第二步反應中形成的丙酮酸的測定可以通過 LDH 反應中添加 NADH。

過量的 NADH 通過堿處理破壞。

NAD（H）

Tris-HClα-酮戊二酸ADP乙酸銨谷氨酸脫氫酶D-乳酸脫氫酶NaOHNADH磷酸鈉緩沖液

熒光光度計

實驗所需「試劑」具體見「其他」

0.1 ml 循環混合物

被測定的 x ul NAD 或 NADPH 溶液［x 為 1～20； 濃度為（3～50）×10^-9 mol/L］。

（20～x）ul 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0

37℃ 培養 30 min

將樣品轉移到 100℃、2 min 來終止反應，接著將樣品轉移至冰浴

每個樣品中加入 0.1 ml 溶液 II，25℃ 孵育 15 min，接著將樣品轉移至冰浴，加入 25 ul 5 mol/L HCl

0.1 ml 的樣品液中加入 0.2 ml 9 mol/L NaOH

60℃ 孵育 10 min， 然后加入 1 ml 水，測定熒光強度。

試劑：

0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.4

0.1 mol/L α-酮戊二酸（二鈉鹽，Mr＝190.1；190 mg 溶于 10 ml 水中）

1 mol/L 乳酸鹽（鈉鹽，Mr＝112.1；1.1 g 溶于 10 ml水中）

0.01 mol/L ADP（二鈉鹽，Mr＝471.2；47.1 mg 溶于 10 ml水中）

1.0 mol/L 乙酸銨（Mr＝77.1；771 mg 溶于10 ml 水中）

谷氨酸脫氫酶（來自于牛肝臟，40 U/mg，配制溶液：40 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）

D-乳酸脫氫酶（來自于豬心臟，約 550 U/mg，10 mg/ml， 配制溶液：55 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）

9 mol/L NaOH（36 g 溶于 100 ml水中）

0.01 mol/L NADH（71 mg 溶于 10 ml水中）

磷酸鈉緩沖液

8.97 g NaH₂PO₄（單水，Mr＝138）

2.61 g K₂HPO₄（Mr＝174.2）

溶于100 ml水中

溶液Ⅰ（循環混合物）

溶液Ⅱ

加入新鮮配置的 1 ml 磷酸鈉緩沖液中；

20 ul 10 mmol/L NADH

儲藏溶液 LDH 1.5 ug（稀釋儲藏溶液 100 倍，取 15 ul）