NADP（H） 的測定
NAD（H）的測定
| 實驗方法原理 |
為了測定 NADP（H），可以采用谷氨酸脫氫酶（GluDH）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH） 的偶聯反應：
在指定的條件下，一個 NADP 分子可以催化生成 5000～10 000 個 6-磷酸葡萄糖酸鹽。NADP的濃度為 10-9 mol/L（1 ul 含有 10～15 mol）時就可以檢測到。ADP 作為 GluDH 的催化劑。 停止酶循環反應后，可以利用一個獨立的 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶反應來測定 6-磷酸葡萄糖酸鹽的生成量：
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| 實驗材料 | NADP |
| 試劑、試劑盒 | Tris-HCl α-酮戊二酸 D-葡萄糖-6-磷酸鹽 ADP 乙酸胺 BSA 谷氨酸脫氫酶 葡萄糖 6-磷酸脫氫酶 6-磷酸葡萄糖酸鹽 EDTA 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶 |
| 儀器、耗材 | 熒光光度計 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「試劑」具體見「其他」 1. NADP 或 NADPH 的測定 0.1 ml 循環混合物：
被測定的 x ul NADP 或 NADPH 溶液［x 為 1～20； 濃度為（3～50）×10-9 mol/L］。 （20～x）ul 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0 37 ℃ 培養 30 min 將樣品轉移到 100℃、2 min 來終止反應。 2. 6-磷酸葡萄糖酸鹽的熒光測定
在發射 470 nm（激發 325 nm）處測定熒光、實驗可以通過 6-磷酸葡萄糖酸鹽標準曲線來定量。
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| 注意事項 | |
| 其他 |
試劑： 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0 0.1 mol/L α-酮戊二酸（二鈉鹽，Mr＝190.1；190 mg 溶于 10 ml 水中） 0.1 mol/L D-葡萄糖-6-磷酸鹽（二鈉鹽，氫氧化物，Mr＝304.1；304 mg 溶于 10 ml 水中） 0.01 mol/L ADP（二鈉鹽，Mr＝471.2；47.1 mg 溶于 10 ml 水中） 1.0 mol/L 乙酸胺（Mr＝77.1；771 mg 溶于 10 ml 水中） BSA（20 mg/ml）； 谷氨酸脫氫酶（來自于牛肝臟，40 U/mg，配制好的溶液：40 U/0.1 ml 0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.0） 葡萄糖 6-磷酸脫氫酶（來自于酵母，300 U/mg，配制好的溶液： 60 U/0.1ml 0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.0） 0.01 mol/L 6-磷酸葡萄糖酸鹽（三鈉鹽，Mr＝342.1；34 mg 溶于 10 ml 水中） 0.01 mol/L NADP（Mr＝787.4；79 mg 溶于 10 ml 水中） 0.1 mol/L EDTA（Mr＝292.2；292 mg溶于 10 ml 水中） 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（來自于產朊假絲酵母，20 U/mg； 配制好的溶液：0.1 U/0.1 ml 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）
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