此步細節：
1：在使用注射器時，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會將小柱內的薄膜擠破，失去作用。
2：乙酸銨、糖原不需新鮮配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸銨室溫即可，因為這樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在4度，取出用時也會有很多溶質析出。
3：異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配制，但如果用量大，現場配也很方便。
此步關鍵是在樹脂與DNA的結合上，這就再次強調第二部分調亞硫酸鈉PH值得重要性。因為樹脂與DNA結合需要有一個適當的PH，如前一步沒做好，此步樹脂不能與DNA很好結合，將會帶來災難性后果，即DNA隨著液體被擠出了，洗脫時實際已沒有任何DNA了。
第四部分 修飾后DNA用于PCR
這一步也沒有懸念。我主要談一下這里面的幾個比較棘手的問題：
1：引物問題：我感覺自己設計引物有相當的難度，我曾設計過幾對引物，并且試驗了一下，但以失敗告終。如果時間充裕、作的又是比較新的基因文獻不多，自己設計引物沒有問題。如果不是這樣，還是參考文獻更好些。首先查閱SCI分值高的文獻，然后是著名實驗室的文獻，如果國內有做的，更好了，可以直接聯系咨詢。查到序列后，一定要和Genbank中的序列進行比對，防止有印刷錯誤造成的個別堿基的差別。然后再到google上搜一下，看用的人多否，體系條件是否一樣。用的人多、體系條件一樣，表明可重復性比較強。我也是按此行事，算比較順利。
2：Taq酶問題：有文獻用高保真的金牌
Taq（Platinum），但我感覺只要體系正確、變性退火等條件合適，一般的熱啟動酶是可以的。我開始使用的是Takara的LA
Taq，很好用，配有10x含mg++的LA緩沖液。有時候用沒了，暫時以Takara
的普通Taq酶也可以。如何選擇，可以根據自己的情況。初作者還是用好一點的酶。
3：PCR的條件：變性一般都選擇95度，3min。其余我感覺還是根據文獻，退火可以根據你的引物的退火溫度在小范圍內嘗試。一般和文獻報道差別不大。只是擴增片斷特異性的問題。建議根據文獻。
4：做PCR的EP管最好選擇進口的，壁薄且厚度均勻，這可以保證溫度的迅速變化可以及時傳遞給管內的反應液，使體系真正在所設定的溫度下運行。
5：PCR儀：如果在某一個儀器上作出來了，最好一直用此儀器繼續。不同的儀器“脾氣”也不一樣，但EP管必要和儀器內的插孔緊密結合方好，留有空隙，我認為會影響溫度的傳遞。
這一部分有些啰嗦，只是個人一些不成熟經驗。有疑問處，請大家指出，交流。今天先到這里，現寫一些內容，比較費勁，總是不能一揮而就。望見諒。歇息一會準備寫最后藍白斑篩選克隆這一部分。
第五部分 PCR產物的凝膠回收
這一步比較簡單，可以購買一個凝膠PCR產物回收試劑盒，國產的就很好、價格也合理，比如TIANGEN的產品（用過）。把切下來的膠按說明書操作即可。
幾個細節：
1：PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。
2：凝膠DNA回收時在300nm紫外燈下觀察條帶位置，切取目的片斷所在位置的凝膠，盡量小，保證特異性。
3：紫外照射時間不能過長，否則對DNA有損傷。
4：回收后的DNA如不馬上用就儲存于-20度，在數月內是很穩定的。
第六部分 PCR產物與T載體的連接和轉化、藍白斑篩選
1：連接T載體（本實驗使用的是Promega的試劑盒）
15ul體系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，過夜。
2：連接產物的轉化
1）-70度冰箱內取出感受態細菌，融化后置于冰上；
2）連接產物15ul 全部加入，至于冰上30分鐘；
3）42度， 90秒鐘；
4）冰上2分鐘；
5）800ul LB培養基；
6）280rpm，37度，搖床45分鐘（將管放水平了搖，保證菌液搖勻）；
7）8000rpm，1分鐘；在超凈臺內去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱過夜；（板為含有氨芐青霉素的固體LB培養基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混懸液
過夜后可見板上長出很多藍色或白色斑點，取白色斑點，尤其是藍色斑點周圍的白色斑點，此處自聯率較低。
3：取白斑，劃種于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底劃出分區，進行標記。根據需要，一般一板作50個克隆沒有問題。
針頭挑白斑劃2道于板上相應區域內。
37度，孵箱過夜。
4：聯系測序公司送測序。一般一個克隆在35-45元。
這一部分的細節：
1：涂板要均勻，保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上；
2：不要讓藍白斑長得太滿，否則選取克隆時容易一下挑2個。