（1）全身用藥治療絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、各類急性白血病、乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、消化道癌、宮頸癌及惡性淋巴瘤等。
（2）動脈插管灌注對頭頸部癌和肝癌有較好療效。
（3）大劑量甲氨蝶呤輔以甲酰四氫葉酸鈣救援（HDMTX-CFR療法），作為骨肉瘤、軟組織肉瘤、惡性淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌。小細胞肺癌等術后輔助化療或晚期病變全身治療有一定療效。
（4）甲氨蝶呤于1988年開始用于治療類風濕關節炎（RA）。而甲氨蝶呤與阿達木單抗等生物制劑聯合用藥，可以更有效地緩解RA患者的疾病癥狀，減緩關節損傷的進展（X線顯示），并且可以改善身體功能。與傳統藥物相比，阿達木單抗等生物制劑的療效強且持久，且耐受性良好。
（5）還可在異位妊娠局部胎囊注射緩解出血。