2、選擇標記
選擇標記一般為對應于營養缺陷型受體的野生型基因，常用HIs4。由于P．Pasotris不利用蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作為標記。AMP：氨芐抗性基因，可在大腸
桿菌中篩選。G418和Zeocinr(Invitrogen，sandiego，CA)也是篩選標記，使得到高拷貝的轉
化子，這是因為表達載體上外源基因和卡那基因相偶聯。Zeocinr在E.coli和P.Pastoris宿主中都表達，因此縮短了穿梭載體的長度，但
Zeocin是一種強誘變劑，可能導致轉化子產生突變。
3、信號肽序列
表達蛋白的分泌需要信號肽引導并沿一定途徑才能分泌至細胞外。P.Pastoris自身分泌的蛋白質很少，分泌表達是一種理想的表達方式，胞外表達有利于蛋白質的提取和純化，同時有助于不分泌型的蛋白質使其分泌，而像人血清蛋白(HSA)和牛凝乳酶(Rennin)，用自身信號肽序列即可在
P．Pastoris中成功表達。然而，對于有些蛋白的自身信號肽，P.Pastoris不能有效利用，如反轉錄酶。
甲醇營養型酵母表達系統一般利用2種來源的信號肽序列：一是外源基因本身攜帶的信號肽序列；二是來源于酵母的信號肽序列，如a-因子、PHO1信號肽序列。P.Pastoris信號肽主要包括磷酸酶(PHO)、轉化酶(inertase)和α-因子，其中α-因子信號肽(
MF)使用最廣。
α-因子信號序列是由87個氨基酸組成，來自于S.cerevsiae的α性成熟因子前導序列，并且已將這段序列編碼的信號肽插入到幾個
P.Pastoris的表達載體中(Invitrogen)。在構建α-因子信號肽融合基因時，需保留KeX2蛋白酶切位點附近的谷氨酸一丙氨酸
(Glu-Ala)間隔區，GluAla的存在會避免錯誤切割的發生。研究證明：信號肽引導的外源蛋白在P.Pastoris中均能被有效切割。α-MF
是在高爾基體中被KeX2蛋白酶識別并切割，而PHO1一般在內質網被切割。
酵母細胞對信號肽序列的識別有一定的靈活性，在一定程度上可以識別外源蛋白的信號肽進行蛋白輸送，但利用外源基因自身信號肽序列不能得到高表達量和高分泌效率。來源于P.pastoris酵母酸性磷酸酶(PHO1)基因的信號肽序列也常用于甲醇營養型酵母表達載體，由該信號肽引導的蛋白一般僅能分泌至膜周質，分泌效應不如a-因子信號肽強。
4、載體
（1）表達載體種類
有幾種甲醇酵母是用于表達外源蛋白的受體菌，如GS115，KM71和SMD1168等，它們都是組氨酸缺陷型。如表達載體上攜帶有組氨酸基因，可補償宿主的組氫酸缺陷，因此可以在不含組氨酸的培養基上篩選轉化子。這些受體菌自發突變為組氨酸野生型的概率一般低于10-8，通常不予考慮。GS115
表型為Mut+。重組表達載體轉化GS115后，長出的轉化子既有可能是Mut+，又有可能是Muts，可以在MM和MD培養基上鑒定表型。
SMDI168和Gsll5類似，不同的是它是蛋白酶缺陷型，可減弱蛋白酶對外源蛋白的降解作用。KM71沒有AOX1基因，本身就是Muts，因此轉化后所有的轉化子都是Muts，不必鑒定表型。
Invitrogen公司構建的多種P.Pastoris表達載體，既有胞內表達的，又有分泌表達的。這些載體都包括一個表達盒
(cassette)，它是由0.9 kb的5 ‘A0X1序列片斷和約0.3 kb的轉錄終止基
因的3’序列組成。分泌型表達載體主要有pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；胞內表達的載體主要有：pHIL-
D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)等。這些載體在結構上有共同點：
AOX1：含有AOX1啟動子，可調控異源蛋白表達，同時也是載體和受體菌染色體發生重組的位點；
McS：多克隆位點，允許外源基因插入；
Sig：編碼N末端信號肽序列，可引導蛋白分泌；
1vr：轉錄終止和多聚腺苷酸化序列，允許mRNA有救轉錄終止和多聚腺苷酸化
3’AOx1：TT序列下游區域，同源重組位點之一；
His：編碼組氨酸，提供轉化子的篩選標記，也是重組位點之一；
Amp：氨芐抗性基因，允許在大腸桿菌中篩選。
按Invitrogen公司推出的Kit可分為3類。第一類屬高拷貝型：如
pPIC3K和pPIC9k都攜帶有卡那基因，可通過提高G418濃度，很容易得到高拷貝的轉化子。
PA0815是先在體外構建串聯的外源基因多拷貝(可連接8個拷貝子)，轉化后可得到已知的多拷貝轉化子。第二類為易篩選型：pPIczA，pPIcza，不需要營養缺陷篩選、不需要氨芐抗
性篩選，且載體小，易操作。但是篩選標記為Zeocin，它是很強的誘變劑，可使外源蛋白突變。第三類為原始型：pPIc9等操作繁瑣，是單一拷貝，有高水平表達外源蛋白的時候，但不多見。
酵母表達載體有多種，采用較多的是整合型表達載體，可通過整合型載體將外源基因整合到酵母染色體上，獲得遺傳性穩定重組子，而且能通過前導信號肽引導外源蛋白的分泌表達。并能識別及有效地切割這些信號肽。外源基因在酵母中的表達一般是采用酵母基因的啟動子。目前，利用最多的是美國
Invitrogen公司出售的畢赤酵母表達載體和相應的試劑盒。該公司構建了多種甲醇酵母表達載體，既有胞內表達的，又有分泌表達的，該種表達載體表達外源蛋白時，需要加人甲醇進行誘導，不利條件是在表達產物中引人了有毒的甲醇。
典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調控序列，主要的結構包括：5’AOX1啟動子片段、多克隆位點(MCS)、轉錄終止和polyA形成基因序列(TT)、篩選標記(His4或
Zeocin)、
3’AOX1基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質粒，它還有部分pBR322質粒或COLE1序列。如果是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5’端和啟動子的3’端之間插人了分泌作用的信號肽序列。在這個分泌信號的引導下，外源蛋白在內質網和高爾基體中經修飾和加工后能夠由胞內轉移至胞外，將成熟的蛋白質分泌到細胞外。
pGAP系列表達載體
美國 Invitrogen公司的產品 pGAeZ和 pGAPza，是一種無需甲醇誘導而能表達外源蛋
白的畢赤酵母載體。pGAP系列是典型的組成型酵母表達載體，為穿梭型表達載體，能在大腸桿菌和酵母中進行遺傳復制。是以畢赤酵母中磷酸甘油酸脫氫酶
(GAP)基因啟動子作為外源基因啟動子，該啟動子是組成型表達的，所以不存在誘導的問題，在以葡萄糖為碳源的培養基上就可以表達。通過利用美洲小長尾猴重組a-1,3半乳糖轉移酶，來表達
a-半乳糖抗原，在P／ch／a
pastor／s酵母中獲得了表達。是在PGAP啟動子的啟動下，分泌到培養基中，并且表達產物與6×His尾巴相融合，以利于純化。同時，由于不用加人甲醇進行誘導，所以在表達產物中不會引人有毒物質，有利于表達產物的商品化。
（2）表達載體的整合方式
整合載體轉化受體菌時，可以和染色體上的相應位點發生互換，從而整合到酵母菌染色體上。通常有以下幾種整合方式：
①雙位點互換。發生在染色體AOX1或 GAP位點和表達質粒中的PAOX1或 PGAP及轉錄終止區，產生的表達菌的表型為His+Mut+。
②AOX1或GAP單位點互換。發生在染色體和表達質粒的AOX1或GAP區，外源基因的表達單位插人在染色體 AOX1或GAP基因的上游或下游，這一過程可重復發生，使得更多拷貝的表達單位插人到基因組中，產生的表型是His+Mut+。
③His單位點置換。發生在染色體 His位點和表達質粒的 His位點，使得1個或多個表達單位插人在 His位點，產生的表型也是His+Mut+。