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  • 發布時間:2020-07-27 16:44 原文鏈接: 電泳技術原理、分類及分析方法(三)

    (四)其他電泳技術
    ⒈IEF/SDS-PAGE雙向電泳法 1975年O′Farrall等人根據不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了 IEF/SD S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳(管柱狀)為第一向,SDS-PAGE 為第二向(平板)。在進行第一向IEF電泳時,電泳體系中應加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白質樣品中除含有這兩種物質外還應有二硫蘇糖醇以促使蛋白質變性和肽鏈舒展。IEF電泳結束后,將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應用的樣品處理液(內含SDS、β-巰基乙醇)中振蕩平衡,然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端,即可進行第二向電泳。
    IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質(包括核糖體蛋白、組蛋白等)的分離是極為精細的,因此特別適合于分離細菌或細胞中復雜的蛋白質組分。
    ⒉毛細管電泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛細管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質的方法,即微柱膠電泳,均一濃度的凝膠是將毛細管浸入凝膠混合液中,使凝膠充滿總體積的2/3左右,然后將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上,封閉管底,用一支直徑比盛凝膠的毛細管更細的硬質玻璃毛細管吸水鋪在凝膠上。聚合后,除去水層并用毛細管加蛋白質溶液(0.1-1.0μl,濃度為1-3mg/ml)于凝膠上,毛細管的空隙用電極緩沖液注滿,切除插入粘土部分,即可電泳。
    目前毛細管電泳分析儀的誕生,特別是美國生物系統公司的高效電泳色譜儀為 DNA片段、蛋白質及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術溶為一體,在從凝膠中洗脫樣品時,連續的洗脫液流載著分離好的成分,通過一個連機檢測器,將結果顯示并打印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高分辨率,生物相容性的優點,又可方便地連續洗脫樣品。
    各電泳法,除另有規定外,照下述方法操作。
    一、紙電泳法
    1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。 常用的水平式電泳室裝置如圖,包括兩個電泳槽 A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B;兩側的電泳槽均用有機玻璃(或相應材料)板 C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5~0.8cm)D;里格為可放濾紙 E的有機玻璃電泳槽架F,此架可從槽中取出;兩側電泳槽A內的鉑電極 D經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。 電源為具有穩壓器的直流電源,常壓電泳一般在 100~500V,高壓電泳一般在500~10 000V。
    2. 操作法
    (1) 電泳緩沖液
    枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0) 取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g 與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水 4000ml,使溶解。
    (2) 濾紙
    取色譜濾紙置 1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH 值不低于4,置60℃烘箱烘干,備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙,或根據電泳室的大小裁剪,并在距長度方向一端 5~8cm處劃一起始線,每隔2.5~3cm 處做一記號備點樣用。
    (3) 點樣 有濕點法和干點法。
    濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中,濕潤后,取出,用濾紙吸干多余的緩沖液,置電泳槽架上,使起始線靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩沖液中,然后用微量注射器精密點加供試品溶液,每點 10μl,共3點,并留 2個空白位置。
    干點法是將供試品溶液點于濾紙上,吹干、再點,反復數次,直至點完規定量的供試品溶液,然后用噴霧器將濾紙噴濕,點樣處最后噴濕,本法適用于稀的供試品溶液。
    (4) 電泳
    于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極,接通電泳儀穩壓電源擋,調整電壓梯度為 18~20V/cm,電泳約1小時45分鐘,取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出紫色斑點的位置。
    (5) 含量測定
    剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙,剪成細條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,搖勻,放置1小時,用3號垂熔玻璃漏斗濾過,也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項下的規定測定吸收度,并按吸收系數計算含量。

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