二、醋酸纖維素薄膜電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 巴比妥緩沖液(pH8.6)
取巴比妥 2.76g,巴比妥鈉15.45g,加水溶解使成1000ml。
(2) 氨基黑染色液
取 0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3) 漂洗液
取乙醇 45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。
(4) 透明液
取冰醋酸 25ml,加無水乙醇75ml,混勻。
3.操作法
(1) 醋酸纖維素薄膜
取醋酸纖維素薄膜,裁成 2cm×8cm的膜條,將無光澤面向下,浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夾于濾紙中,輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。
(2) 點樣與電泳
于膜條上距負極端 2cm處,條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2~3μl,在 10~12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4~5cm為宜。
(3) 染色
電泳完畢,將膜條取下浸于氨基黑染色液中,2~3 分鐘后,用漂洗液浸洗數次,直至脫去底色為止。
(4) 透明
將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中 10~15分鐘,取出平鋪于潔凈的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度計上測定和作標本長期保存。
(5) 含量測定
未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定,一般采用洗脫法或掃描法,測定各蛋白質組分的相對百分含量。 洗脫法
將洗凈的膜條用濾紙吸干,剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶,分別浸于1.6%的氫氧化鈉溶液中,振搖數次,至洗脫完全,
于一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位,同法操作作對照。先計算吸收值總和,再計算各蛋白組分所占百分率。 掃描法
將干燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射 (未透明薄膜)
或透射(已透明薄膜)方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖,橫坐標為膜條的長度,縱坐標為吸收度,計算各蛋白組分的百分含量。
亦可用微機處理積分計算。
三、瓊脂糖凝膠電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0)
取冰醋酸 50ml,加水800ml混合后,用氫氧化鋰調節pH至3.0,再加水至
1000ml。
(2) 甲苯胺藍溶液
取甲苯胺藍 0.1g,加水100ml使溶解。
3.操作法
(1)制膠
取瓊脂糖約
0.2g,加水10ml,置水浴中加熱使溶脹完全,加溫熱的醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0)10ml,混勻,趁熱將膠液涂布于大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度約
3mm,靜置,待凝膠結成無氣泡的均勻薄層,即得。 (2) 標準品溶液及供試品溶液的制備照各藥品項下規定配制。
(3) 點樣與電泳
在電泳槽內加入醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0),將凝膠板置于電泳槽架上,經濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板負極端分別點樣 1μl,立即接通電源,在電壓梯度約 30V/cm,電流強度1~2mA/cm的條件下,電泳約20分鐘,關閉電源。
(4) 染色與脫色
取下凝膠板,用甲苯胺藍溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景無色為止。