電泳技術在醫學中的應用（二）

6. 高效毛細管電泳及高效毛細管電泳2質譜聯用:高效毛細管電泳是以彈性石英毛細管為分離通道,以高壓直流電場為推動力,依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的電泳分離分析方法。利用毛細管代替平板凝膠,分離效率得以提高。高效毛細管電泳的應用范圍從小分子、無機離子到生物大分子,甚至整個細胞,從帶電粒子到中性分子都可用高效毛細管電泳方法進行分析。目前,毛細管與質譜的接口難題已經解決,人們能利用毛細管電泳的高效分離能力與質譜的鑒定技術聯用發揮其特殊功能,發現未知的化合物。尤其是陣列毛細管電泳儀已經問世,這將克服目前大多數商品化毛細管電泳儀只能進行單根毛細管電泳的缺陷,這種高通量的新方法將會給后基因組時代的基因分析帶來革命性的變化。

7. 毛細管電泳芯片:利用毛細管電泳芯片可以進行DNA長度、序列和基因分型等分析,在臨床檢測,尤其在遺傳病的診斷中具有重要意義。現在分離DNA,是利用芯片分離熒光標記的寡核苷酸,整個分離過程在45 s之內,而芯片的長度僅為318 cm。因為其可承載高電壓(2 300 V / cm)并具有較小的樣品體積,故有利于得到較好的分離效果。而用傳統的毛細管電泳分離技術分離DNA樣品,通常需要10～30 min,電壓也只能加到500 V / cm。另外有人制作的用于高速DNA分離的芯片,有效長度僅為315 cm,分離從70～1 000bp的DNA 片斷,時間在120 s以內。目前,高速、高通量的毛細管電泳芯片已經發展得比較完善。2002年筆者曾在瑞典召開的第十五屆國際微量分離與分析會議上見到Caliper公司設計的DNA電泳芯片,即在一個光盤大小的芯片上有96個毛細管電泳陣列,分別與96個樣品池相連,呈輻射狀,并采用一個旋轉的共聚焦熒光檢測系統對信號進行檢測。此系統可以同時對96個不同的樣品進行分離,分離檢測過程在8 min以內。

8. DNA測序系統:該系統利用凝膠毛細管的原理,將多道毛細管陣列設計,用4種不同的熒光染色標記4種核苷酸,在模板上合成DNA單鏈,然后在DNA外切酶的作用下進行堿基的連續水解和釋放,用激光識別和記錄釋放的堿基。可用于DNA序列測定,雜合子自動檢測,點突變分析,等位基因鑒定, SNP篩查,雜合性缺失檢測,AFLP指紋圖譜,微衛星DNA的不穩定性分析,基因表達,測序質量評估,序列比較等。20世紀90年代中期,測序儀重大改進,集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳。2001年完成人類基因組框架圖提前完成得益于多通道、集束化的毛細管凝膠電泳技術的出現。目前,在我國已有少數醫院開始采用8 通道的DNA測序,系統開展用拉米夫定治療乙型肝炎病毒(HBV)的YMDD突變檢測。

二、電泳技術臨床應用

隨著新的電泳技術的出現,各種自動化電泳分析儀問世并相繼被引入臨床實驗室,電泳技術在臨床疾病的診斷中正發揮越來越多的作用,特別是為各種體液蛋白質、同工酶等的檢測提供了新的手段。

1. 血清蛋白電泳:新鮮血清經醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后,常見白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5條帶。血清蛋白質電冰圖譜是了解患者血清蛋白質全貌的有價值的方法,可用為初篩試驗。急性炎癥或急性時相反應時常以α1、α2 區帶加深為特征;妊娠型α1 區帶增高,伴有β區帶增高;腎病綜合征、慢性腎小球腎炎時呈現白蛋白下降,α1、β球蛋白升高;缺鐵性貧血時可由于轉鐵蛋白的升高而呈現β區帶增高,而慢性肝病或肝硬化呈現白蛋白顯著降低,γ球蛋白升高2～3倍,示免疫球蛋白( Ig)多克隆高,甚至可見β～γ橋,還可在γ區呈現細而密的寡克隆區帶;單克隆Ig異常癥(M蛋白血癥)則在電冰區帶α～γ區呈現致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生區帶(M蛋白區帶) 。

2. 尿蛋白電泳:尿蛋白電泳的主要目的是在無損傷的情況下,協助臨床判斷腎臟病變的嚴重程度。當不能進行腎活檢時,尿蛋白電泳結果能很好地協助臨床判斷腎臟的主要損害。尿蛋白電泳后呈現出中、高分子蛋白區帶主要反映腎小球病變,呈現出低分子蛋白區帶可見于腎小管病變或溢出性蛋白尿(如本周蛋白) ;混合性蛋白尿可見到各種分子量區帶,示腎小球和腎小管均受累及。對臨床癥狀不典型的患者及微量蛋白尿患者的診斷及各種腎臟疾病治療過程中病情的動態分析也具有很大價值。

3. 腦脊液蛋白電泳:若在腦脊液(CSF)標本中檢出寡克隆區帶,而其相應血標本中未能檢出區帶,反映是由中樞神經系統本身合成的Ig,具有重要臨床意義。但為保證正確的比較與分析,須將患者血清和CSF在同一天同步進行分析,以論證不同來源的Ig。中樞合成Ig是中樞神經系統疾患的一個重要信號,主要用于多發性硬化癥、癡呆、脊髓炎、亞急性腦白質炎、神經性梅毒等中樞神經系統疾患的診斷和鑒別診斷。
 
4. 血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳:應用電泳法鑒別患者血液中Hb的類型及含量對于貧血類型的臨床診斷及治療具有重大意義。HbA2 增高是β2輕型地中海貧血的一個重要特征, HbA2 減低見于缺鐵性貧血及其他Hb合成障礙性疾病(常見如α2地中海貧血) 。電泳發現異常Hb如HbC、HbD、HbE、HbK和HbS等則可診斷為相應的Hb分子病。在酸性條件下電泳,可將糖化血紅蛋白的不同組分HbA1 a, HbA1 b和HbA1 c分離開來, HbA1 c形成與RBC內葡萄糖有關,可特異性反映測定前6 ～ 8周體內葡萄糖水平。此外,糖化血紅蛋白可對某些患者因HbF增高所造成HbA1 c假性升高作出解釋。

5. 免疫固定電泳:可對各類Ig及其輕鏈進行分型,最常用于臨床常規M蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆Ig增殖病、單克隆Ig病、本周蛋白和游離輕鏈病、多組分單克隆Ig病、重鏈病、CSF寡克隆蛋白鑒別、多克隆Ig病的診斷和鑒別診斷。

6. 同工酶電泳:臨床上用于同工酶或同工酶亞型分析。(1)乳酸脫氫酶(LD /LDH)同工酶:用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)法可分離出5種同工酶區帶(LD1 ～LD5 ) 。主要用于急性心肌梗死(LD1 >LD2 )及骨骼肌疾病(LD5 升高)的診斷和鑒別診斷。惡性腫瘤、肝硬化時可見LD5 明顯升高,或在胸腹水中出現一條異常LD6區帶。(2)肌酸激酶(CK)同工酶:采用AGE法可分離出3種CK同工酶。當出現異常同工酶如巨肌酸激酶1 (CK1 ) 、巨CK2 等時,從電泳圖譜上很容易發現。CK2MB在心肌梗死早期增加和短時間內達峰值也是心肌再灌注的指征。CK2BB增高見于腦膠質細胞瘤、小細胞肺癌和胃腸道惡性腫瘤,后者還常有CK2Mt增高。 (3) CK同工酶亞型:指CK2MM亞型(CK2MM1、CK2MM2、CK2MM3 )和CK2MB亞型(CK2MB1、CK2MB2 ) ,常采用瓊脂糖凝膠IEF或高壓電泳。采用瓊脂糖凝膠高壓電泳可進行CK同工酶亞型的常規快速分析,用于臨床早期心肌損傷的臨床診斷與鑒別診斷。主要用于急性心肌梗死的早期診斷,也可用于確定心肌再灌注、溶栓治療后的病情觀察。(4)堿性磷酸酶(ALP)同工酶:可采用AGE法進行ALP同工酶的常規快速分析。肝外阻塞性黃疸、轉移性肝癌、肝膿瘍和膽石癥時膽汁ALP檢出率很高,并伴有肝ALP增加,而肝內膽汁淤積、急性肝炎、原發性肝癌等主要表現為肝ALP增多,大多數不出現膽汁ALP。甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、骨折、肢端肥大癥所致骨損傷等,均引起骨ALP同工酶增加。骨ALP、高分子ALP同工酶對惡性腫瘤骨轉移或肝轉移的陽性預示值較總ALP高。胃腸道腫瘤、肺癌等惡性腫瘤時出現類腸型ALP。(5)γ2谷氨酰轉肽酶(γ2GT/GGT)同工酶:用CAE或AGE法可將γ2GT同工酶分離為γ2GT1 ～γ2GT4 ,正常人只見γ2GT2 和γ2GT3 ,重癥肝膽疾病和肝癌時常有γ2GT1 出現,γ2GT4 與膽紅素增高密切相關。

7. 脂蛋白電泳:脂蛋白電泳檢測各種脂蛋白(包括膽固醇和TG)主要用于高脂血癥的分型、冠心病危險性估計,以及動脈粥樣硬化性及相關疾病的發生、發展、診斷和治療(包括治療性生活方式改變、飲食及調脂藥物治療)效果觀察的研究等。

三、現狀與展望

我國在電泳技術臨床應用上與國外相比,存在明顯差距。對于電泳項目,國內一般以血清蛋白為主,而國外所做項目包括血清蛋白、尿蛋白、CK、LD、ALP、GGT同工酶、各種脂蛋白的膽固醇/甘油三酯等。對于電泳試劑,歐美這幾年均以瓊脂糖凝膠電泳片占95%以上,國內仍有40%市場采用醋纖膜電泳片。分析這些差距,有主觀因素,也有客觀原因。目前國內有不少臨床實驗室仍采用較落后的電泳設備或手工電泳方法,既不能及時、準確獲得分析結果,也使得許多新的檢驗項目不能開展并應用于臨床常規分析,影響了臨床相關疾病的診治和檢驗醫學的發展。也有一些較大規模的醫院,雖然購置了先進的自動化電泳系統,但由于宣傳介紹不夠,臨床醫生對電泳檢測項目了解少而不開檢驗申請單。

從目前臨床實驗室的要求來看電泳儀必須具有下列功能:

(1)全自動:必須達到人員離機作業,由點樣到出報告沒有人工動作。

(2)速度快:所有項目應在60 min內完成同時具備急診項目如CK、LD等同工酶及亞型項目。

(3)項目全:除了血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、CK、LD同工酶等傳統項目外必須還能完成尿蛋白、腦脊液蛋白、免疫固定(單克隆抗體) 、ALP和GGT同工酶、膽固醇(高密度/極低密度/低密度脂蛋白) 、脂蛋白( a)等最新檢驗項目。

(4)敏感度高:必須采用敏感度高的電泳片。如瓊脂糖凝膠系統,才能得到準確度高,分辨率高的電泳結果。