電泳、轉膜

轉膜是把DNA從瓊脂糖凝膠中轉移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進行各種后續研究（如RFLP分析，陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。

實驗目的：

掌握Southern blotting的原理及操作步驟。

實驗原理：

1. 轉膜的方式：

　　向上的毛細管轉移

　　向下的毛細管轉移

　　同時向兩張膜轉移

　　電轉移

　　真空轉移

2. 固相支持物的種類及選擇：

　　硝酸纖維素膜：非共價結合，易脆，易丟失DNA，< 500 bp的DNA無效，轉膜前的工作（從提高轉膜效率,利于轉膜后使用等）。

　　尼龍膜（帶正電荷的）：高強度，不易破損，具有較大的DNA結合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸以共價結合方式不可逆的結合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能，無論用哪邊均可以經久耐用，可反復利用10次以上（10-20次），經毛細管（毛細吸附）作用，把DNA從凝膠上轉到膜上。DNA轉到膜上是復制膠上的帶型，在80-100℃真空干燥2-4hrs，即可固定DNA。

3. 轉移緩沖液（transfer buffer）的選擇：

　　帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度（SSC），但不能充分發揮膜潛能；0.4N NaOH，共價結合DNA是最大優點。

　　硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進DNA與膜結合（20×SSC），低鹽離子強度導致小片段DNA在轉移過程中丟失，pH>9，DNA不能與膜結合。

4.轉膜時間（duration of transfe）約12 hrs

　　取決于毛細管系統，DNA大小，膠厚度（＜5mm）及濃度（＜1%）。DN分子量A大小決定時間長短，部分去嘌呤減小DNA，堿轉移2hrs大部分結合到膜。DNA轉移的效率較難判斷，只有在轉膜結束后，通過EB染色及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應嚴格操作。

實驗材料及試劑：

酶消化好的DNA樣品，尼龍膜，0.2N HCl，0.4N NaOH等。

實驗步驟：

1. 0.8%瓊脂糖電泳
　　制膠：注意瓊脂糖的質量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml 0.8%瓊脂糖凝膠，采用42孔梳子（經濟，高效）制樣；
　　點樣：DNA樣品中指示劑量稍多。
　　電泳：一般1～1.5V/cm的電壓，使DNA遷移到適當距離，一般指示劑約移動10～11cm（大電泳槽：40V×12～15hrs，小電泳槽30V×4～5hrs） 。

2.轉膜前的準備：
　　依膠大小每塊凝膠準備兩張比膠稍大的濾紙（11×12.5cm），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（10×10.5cm），兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

3.一玻璃盤中加入足量的0.4N NaOH，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋（操作示范）。

4.凝膠的預處理： 
　　a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右上角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號。
　　b) 把凝膠翻面，放入加有足量的0.2N HCl玻璃盤中，輕輕搖動10min，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）。
　　c) 倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠。
　　d) 倒去蒸餾水，加0.4N NaOH中和。
　　e) 同時在鹽橋濾紙上灑些0.4 NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡） 。

5.膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）。

6.在膠面上倒足夠量0.4N NaOH，小心放置膜（預濕0.4N NaOH）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動） 。

7.膜上放2張濾紙，濾紙大小為15×12cm。

8.放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約500g的重物，轉膜12 hrs左右。

9.轉膜完畢，用2×SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。用EB染膠以檢測轉移效果。

10.用兩張濾紙包住膜，置于80～100℃的真空干燥箱中，干燥2～4 hrs。