實驗材料 指數生長的哺乳動物細胞培養液
試劑、試劑盒 Giemsa 染液甲醇磷酸鹽緩沖液丁酸鈉載體 DNA細胞生長培養基
儀器、耗材 組織培養皿基因脈沖器 II電穿孔設備與電轉化池Sorvall H1000B 轉子或類似設備
實驗步驟
材料
緩沖液與溶液
貯存液、緩沖液與試劑的成分見附錄 1。
稀釋貯存液至所需濃度
Giemsa 染液（10%m/V)
Giemsa 染液應使用前用磷酸鹽緩沖液或水新鮮制備的，用 Whatman1 號濾紙過。
甲醇
磷酸鹽緩沖液
溶液使用前過濾除菌，室溫保存
丁酸鈉（500 mmol/L)(備選）
在化學通風櫥內，用10mol/LNaOH 調節丁酸貯存液至 pH7.0。用 0.22um 的濾器過濾除菌，-20°C 保存
核酸與寡核苷酸
載體 DNA(10mg/ml; 如超聲處理的鮭精 DNA)(選用）
線狀或環狀質粒 DNA(用滅菌去離子水配成 1ug/ul)
培養基
細胞生長培養基（完全培養基與選擇性培養基）
離心機與轉子
Sorvall H1000B 轉子或類似設備
特殊設備
電穿孔設備與電轉化池
基因脈沖器 II(Bio-Rad 公司 Cat.oo.165-2105for 110V U.S.Systems and Cat.no.165-2106 for 220V European Systems)。
組織培養皿（35 mm)
此方法適用于用 35 mm 培養皿培養細胞。如果使用其他多孔板、細胞瓶或其他直徑的培養皿，按比例改變細胞濃度與試劑的用量，見表 16-3。
附加試劑
本方案第 10 步可能需要列于第 17 章方案 7 或方案 1 的備選方案中的試劑。
細胞與組織
指數生長的哺乳動物細胞培養液
方法
1. 細胞生長到對數中期或晚期時收集細胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶釋放貼壁細胞。4°C、500 g 離心 5 min(Sorvall H1000B 轉子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 體積的初始培養基重懸細胞，用血細胞計數器計細胞數目（見附錄 8）。
3. 離心（同步驟 1) 收集細胞，室溫下用培養基或磷酸鹽緩沖液重懸細胞至 2.5X106~2.5X107 細胞/ml。
4. 將 400ul 的各等份細胞懸液（106~107 細胞）加入標記好的電轉化池中，冰浴。
5. 設置電轉化參數。一般電容量為 1050uF。電壓在 200V 至 250V 之間，不同細胞系所需電壓不同，平均為 260V。內部阻抗設為無窮大。進行電穿孔前先用一個裝有 PBS 的電轉化池放電至少兩次。
6. 每一裝有細胞的電轉化池內加入 10~30ug、體積最大可至 40ul 的質粒 DNA。[有些人加入載體 DNA(如鮭精 DNA) 使 DNA 總量至 120ug。] 用吸管將 DNA 與細胞輕輕混勻。立刻繼續進行第 7 步。
重要：混勻時不要產生氣泡。
7. 立即將電轉化池移至電極間放電，1~2 min 后，取出電轉化池，冰浴，立即進行下一步操作。
8. 用帶有高壓滅菌吸頭的微量移液器將電穿孔的細胞轉移至 35 mm 培養皿中。用等體積的培養基洗滌電轉化池，洗液加人培養皿。培養皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸鈉休克（見方案 2 第 5 步)，用含適量丁酸鈉的培養基洗滌電轉化池，將洗液與轉化的細胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸鈉的培養基，加入正常培養基。
9. 重復第 6~8 步，電轉化所有 DNA 與細胞樣品。記錄下每一電轉化池的實際脈沖時間以便于比較。
10. 如要獲得穩定轉化體，直接進行第 11 步。如果是瞬時表達，則于電穿孔 24~96 h 后用下述方法之一檢測細胞：
? 如果使用的是表達 E.coli β-半乳糖苷酶的質粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步驟檢測細胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介紹的組化染色
方法操作。
? 如果使用綠色熒光蛋白表達載體，在 450~490nm 光照下用顯微鏡檢測細胞。
方法
1. 細胞生長到對數中期或晚期時收集細胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶釋放貼壁細胞。4°C、500 g 離心 5 min(Sorvall H1000B 轉子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 體積的初始培養基重懸細胞，用血細胞計數器計細胞數目（見附錄 8）。
3. 離心（同步驟 1) 收集細胞，室溫下用培養基或磷酸鹽緩沖液重懸細胞至 2.5X106~2.5X107 細胞/ml。
4. 將 400ul 的各等份細胞懸液（106~107 細胞）加入標記好的電轉化池中，冰浴。
5. 設置電轉化參數。一般電容量為 1050uF。電壓在 200V 至 250V 之間，不同細胞系所需電壓不同，平均為 260V。內部阻抗設為無窮大。進行電穿孔前先用一個裝有 PBS 的電轉化池放電至少兩次。
6. 每一裝有細胞的電轉化池內加入 10~30ug、體積最大可至 40ul 的質粒 DNA。[有些人加入載體 DNA(如鮭精 DNA) 使 DNA 總量至 120ug。] 用吸管將 DNA 與細胞輕輕混勻。立刻繼續進行第 7 步。
重要：混勻時不要產生氣泡。
7. 立即將電轉化池移至電極間放電，1~2 min 后，取出電轉化池，冰浴，立即進行下一步操作。
8. 用帶有高壓滅菌吸頭的微量移液器將電穿孔的細胞轉移至 35 mm 培養皿中。用等體積的培養基洗滌電轉化池，洗液加人培養皿。培養皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸鈉休克（見方案 2 第 5 步)，用含適量丁酸鈉的培養基洗滌電轉化池，將洗液與轉化的細胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸鈉的培養基，加入正常培養基。
9. 重復第 6~8 步，電轉化所有 DNA 與細胞樣品。記錄下每一電轉化池的實際脈沖時間以便于比較。
10. 如要獲得穩定轉化體，直接進行第 11 步。如果是瞬時表達，則于電穿孔 24~96 h 后用下述方法之一檢測細胞：
? 如果使用的是表達 E.coli β-半乳糖苷酶的質粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步驟檢測細胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介紹的組化染色方法操作。
? 如果使用綠色熒光蛋白表達載體，在 450~490nm 光照下用顯微鏡檢測細胞。
? 如果使用其他基因產物，則通過體內代謝標志物進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
為減小不同培養皿之間轉染效率的差異，最好（1）用每一構建體轉染數個培養皿；（2）孵育 24 h 后用胰酶消化細胞；（3）將細胞匯集起來；以及（4）重鋪細胞于數個培養血上
11. 分離穩定轉染體：用完全培養基培養 48~72 h 后，胰酶消化細胞，用適當的選擇性培養基重鋪細胞。每 2~4 天換液一次，持續 2~3 周，目的是去除死細胞殘骸，并允許抗性細胞克隆生長。此后，克隆、繁殖獨立克隆以用于檢測 [方法見 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b(〈細胞實驗手冊〉 的第 86 章）]。
用預冷的甲醇固定細胞 15 min, 然后室溫下用10% Giemsa 染色 15 min, 流水沖洗，這樣可以記錄細胞克隆數目 Giemsa 染液應在使用前用磷酸鹽緩沖液或水新配置，用 Whatman l 號濾紙過濾。 如果使用其他基因產物，則通過體內代謝標志物進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。