電鏡免疫膠體金―銀法染色技術

免疫膠體金―銀染色(immunogold-sliverstaining)技術系20世紀80年代Holgate將免疫 金染色和銀顯影方法結合而建立的一種新型檢測技術，亦可用于電鏡包埋前染色。其基本原理是先進行免疫膠體金染色標記抗原，使其結合在組織細胞抗原所在位置，然后進行物理顯影，當顯影劑中的對苯二酚將銀離子還原成銀原子時，后者將圍繞金顆粒形成一個“銀殼”。“銀殼”本身亦具有催化作用，進一步促使更多銀離子還原，則使“銀殼”越來越大，抗原位置因此而變得清晰，抗原信號也得以放大，故此法是最為敏感的細胞化學方法之一。因金顆粒的電子密度高，加之敏感性也高，故特別適合免疫電鏡的抗原研究。

主要操作程序如下：

1. 組織固定后，5%、10%和20%系列濃度的蔗糖處理，制作冰凍切片，厚10～30gm；

2. 含1%正常羊血清或1%BSA的PBS室溫孵育20分鐘，封閉抗體非特異性結合部位；

3. 含1%氫硼化鈉的PBS孵育20分鐘；

4. 第一抗體孵育，可先置4℃，12～18小時，然后室溫1小時，使抗體充分滲透并結合；

5. PBS漂洗3次，每次5分鐘；

6. 0.1% BSA/PBS液(pH 8.2)漂洗5分鐘，為膠體金結合提供堿性環境；

7. 膠體金標記的第二抗體(pH 8.2)室溫孵育30～45分鐘，需摸索最佳稀釋度；

8. 硝酸銀液避光處理2―10分鐘，顯影時間最好根據實驗結果確定；

硝酸銀液配制：雙蒸水60ml，枸櫞酸緩沖液10ml，對苯二酚1.0g溶于30ml雙蒸水，將三者混合，完全溶解后，用前加入硝酸銀液2.0ml(含35mg硝酸銀)混勻；

枸櫞酸緩沖液的配制：枸櫞酸(C₆ H₈O-7H₂ O)25. 5g，枸櫞酸三鈉(NaC₆H₅O₇ 2H₂ 0)23.5g，用雙蒸水溶解至100ml，即為pH 3.5的枸櫞酸緩沖液。

9. 解剖顯微鏡下選取免疫反應陽性部位。1%OsO₄后固定30分鐘，雙蒸水漂洗；

10. 組織標本的脫水、樹脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等方法同前述。

主要優點：

該方法形成的金銀顆粒電子密度高，反差強，敏感度高；包埋前染色的標本可在解剖顯微鏡下選取陽性部位，結合半超薄切片的應用，能明顯提高工作效率，特別適于抗原含量少的組織細胞的免疫電鏡研究。缺點：顯影處理需在暗室進行，操作較繁瑣；而且增加包埋前免疫染色處理的步驟易導致非特異性著色；另外，單個金顆粒周圍結合的銀粒子不甚牢固，漂洗等處理容易脫離，半定量研究時應注意；此外銀等廢液直接流人下水道，容易導致環境污染。