一、超薄冰凍切片的組織固定1.用干凈的玻璃器皿或者一次性器皿配制固定劑 2.用新鮮配制的固定劑 3.2%~4% 的多聚甲醛和0.2% 戊二醛固定組織。戊二醛對于確保良好的超微結構是必要的。然而由于固定劑的交聯特性，更高濃度（>0.5%) 則嚴重阻礙探針的穿透。因此，對于要用于研究的毎個樣本，必須在超微結構保持和探針穿透性之間找到平衡點。 二、固定和樣本制備小塊組織采用浸泡固定。對于大的組織，如大鼠的腦，建議用灌注固定法。 1.過浸泡固定小塊組織，4℃ 過夜。 2.Imol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌組織 2 次，每次 10 min。 3.用含有 0.15% 甘氨酸的 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌 2 次，每次 10 min。用含 2.3mol/L 的蔗糖 PBS 液浸泡組織至少 4 h，在浸泡時持續滾動小管子。 三、標本制備在切片前將組織塊固定在標本支持物上；我們一般用銅釘固定。 1.用砂紙將釘子表面打粗糙。 2.洗滌釘子以去除小的金屬碎片。 3.用 70% 乙醇洗滌釘子并用吸水紙干燥。 4.從蔗糖溶液中取出組織并用解剖顯微鏡將組織定位于釘子上。. 用吸水紙吸去過多蔗糖。 5.用干凈的鑷子把帶樣本的釘子放入液氮。 6.在液氮中儲存樣本直至使用 四、切片1.把組織樣本從液氮罐轉移至超薄切片機時，應確保沒有融化。 2.超薄冰凍切片的理想溫度為 100~120℃。 3.用干刀完成切片。 4.常做一個厚切片（500nm) 用來定位組織以及檢查固定效果。這種厚切片能用 1% 甲苯胺藍溶液染色。 5.細修剪標本邊緣能改善超薄切片質量。可用剃須刀片或者玻璃刀完成。 6.對于薄切片（40~80nm)，建議使用金剛石刀。 7.用接種環把切片從刀片上分離下來。這種接種環是一個 I5 cm 的塑料把手接了一個小金屬套圈（直徑 2 mm)，金屬套圈充滿 2.3md/L 蔗糖或是蔗糖/甲基纖維素混合液。 8.用接種環收集切片后，讓它們短暫解凍，并立即轉移到篩網上。 9.用蔗糖/甲基纖維素混合液收集切片有兩個優點，一是形態結構保持得更好更完整，二是篩網在冰箱中至少能儲存 3 個月。 10.用透明塑料包被或碳包被的鎳網；銅網在處理過程中會氧化，形成骯臟的沉淀，從而干擾電鏡成像。 五、電鏡原位雜交步驟將篩網（切片面朝下）放到含有 2% 明膠溶液的帶蓋培養皿上，在電熱板上 (37℃) 放置 5 min，然后在 37℃ 孵箱內放置 20 min。 以下步驟都在小滴液體中完成。將小滴試劑（探針和抗體溶液用 5~10ul, 洗滌用 100ul) 點在封口膜蠟上，把篩網切片面朝下放在小滴上。 該方法選用了蛋白 A-金交聯物。因為蛋白 A 與兔 IgG 的親和力高，而與羊 IgG 的親和力低，抗地高辛抗體多為山羊抗體，所以采用兔抗山羊二抗作信號放大的中介。 1.于 0.15% 甘氨酸的 PBS 溫育 2 次，每次 5 min。 2.用 2XSSC 溫育 2 次，每次 5 min。 3.在無探針的雜交緩沖液中預雜交 20 min。 4.加 O.Ig 探針液到 10ul 雜交混合液。 5.雜交篩網放入一個密閉容器中，同時放入濕濾紙以防雜交緩沖液蒸發，于 50C 置 3 h。 6.用 2XSSC 溫育 Imin。 7.用 50% 甲酰胺和 2XSSC 混合液洗滌 2 次，每次 5 min。 8.在密閉和濕化的容器中，于 50°C 用 50% 甲酰胺/2XSSC 混合液嚴格洗滌 3 次, 每次 20 min。 9.用 2XSSC 洗滌 2 次，每次 5 min。 10.用含 I%BSA 的 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min。 11.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 lOmin。 12.在山羊抗地高辛抗體（1:100 稀釋于含 1% 魚明膠的 PBS) 中室溫下溫育 Ih 或者 4C 過夜。 13.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 5 min。 14.用含有 1%BSA 的 PBS 洗滌 3 次，每次 10 min。 15.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 5 min。 16.在兔抗羊抗體（1:100 稀釋于含 1% 魚明膠的 PBS) 中溫育 30 min。 17.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 5 min。 18.用含有 1%BSA 的 PBS 洗滌 3 次，每次 10 min。 19.在蛋白 A-膠體金交聯物（稀釋于 1%BSA 的 PBS，稀釋比例依據使用說明）中溫育 20 min。 20.PBS 洗滌 3 次，每次 15 min。 21.在含 1% 戊二醛的 PBS 中固定 10 min。 22.PBS 洗滌 5 min。 23.蒸餾水洗滌 5 次，每次 Imin。 24.在 2% 乙酸雙氧鈾液中溫育 5 min。 25.用乙酸雙氧鈾/甲基纖維素洗滌 2 次，每次 Is。 26.將切片包埋于乙酸雙氧鈾/甲基纖維素中，置冰上 10 min。 27.用接種環從甲基纖維素液體小滴上移去篩網。 28.用濾紙去除過多的甲基纖維素，將篩網留在接種環上并讓它風干 30 min。 29.轉移篩網到篩網盒中 六、免疫細胞化學電鏡原位雜交（EM-ISH) 與免疫細胞化學組合十分方便，在上述第 22 步后，接用以下方法： 1.用含有 0.15% 甘氨酸的 PBS 洗滌 3 次，每次小于 10 min。 2.用含 1% 魚明膠和 I%BSA 的 PBS 洗滌 5 min。 3.與抗體（兔抗，稀釋于 1% 魚明膠和 1%BSA 的 PBS) 溫育 45 min。 4.用含 I%BSA 的 PBS 洗滌 5 次，每次 Imin。 5.與蛋白 A-膠體金交聯物（稀釋于 1%BSA 的 PBS) 溫育 20 min，可采用不同大小的金比較 ISH 信號的顯示。 6.下接電鏡原位雜交方法的第 20 步。 七、結果以往的研究已經顯示，在軟體動物椎實螺，能合成卵生激素（ELH) 的神經元的軸突內含有大量編碼 ELH 的 mRNAVanMinnen1994)。我們用 EM-ISH 研究這些編碼神經肽的 mRNA 的超微結構定位。首先，我們研究了 ELH 轉錄物在合成 ELH 神經元胞體內的定位。正如所料，發現它們主要與粗面內質網膜相關（圖 3-2A)。其他細胞器中（如線粒體、高爾基體、分泌囊泡）則沒有顯示 ELH 轉錄物的存在，這一點可以從圖 3-4 中觀察到，上述細胞器并未出現 ISH 信號（小金顆粒）和 ELH 免疫反應性物質（大金顆粒）的共定位。然后，我們研究了 ELH 轉錄物在神經元軸突內的精確定位，發現它們主要位于軸漿中（圖 3-3), 在含有 ELH 的核致密囊泡中則沒有其轉錄物的存在，這一點與以前的報道相符（Dirks1996)。 在實驗中，我們主要觀察了編碼 ELHmRNA 的超微結構定位，同時也發現山羊抗地高辛抗血清能與含有 ELH 的核致密囊泡交叉反應。為了避免這一問題，我們使用了鼠抗地高辛單克隆抗體（步驟 12), 然后在第 16 步用兔抗鼠抗體來替代原來使用的兔抗羊抗體。以上數據進一步說明做 ISH 時設立正確對照實驗的必要性。
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