| 實驗方法原理 |
從理論上講，前包埋原位雜交技術的敏感性高于后包埋原位雜交技術，因為前者可觀察到來自整個切片厚度的信號。但是，探針并不一定能穿透整個切片厚度，特別是用較長的探針。為了增加穿透性，經常應用凍融法或者蛋白酶和去污劑處理，而這樣做會導致一些胞內成分如核糖體的丟失，嚴重時會造成超微結構的形態改變。更不利的一個因素是如果沒有強大的透性處理，就不能用較大的金交聯物（>5nm)
顯示雜交探針。 作為替代，可以用過氧化物酶交聯和超微金交聯物（<lnm)。過氧化物酶可以用二氨基聯苯胺顯色，但缺點是分辨率太低，且不能對反應產物定量。超微交聯物則太小而不能在顯微鏡下直接觀察到，必須通過銀染増強后才能被看見（Danscher1981)，但這一過程又可能產生一些大小不規則的銀顆粒，從而妨礙目標物的準確定位。而且，已有報道銀染增強能對超微結構產生負面影響（Eggeretal.1994;Macvilleetal.1995)。 因此，相對而言，后包埋雜交技術是更好的方法，它既能保持良好的超微形態結構又具有合理的敏感性。由于只是切片的表面被標記，還可以用較大金交聯物來顯示雜交探針。親水樹脂（如 LowicrylK4M、HM20、LRWhite、LRGold 以及 Bioacryl) 明顯優于傳統的 EM 包埋劑（如 Epon 和 Araldite)，因為前者的親水性大大增強了探針接近靶核酸序列的能力。有些非包埋方法，如常常提到的冰凍切片技術，則結合了前包埋和后包埋兩種方法的優點，即探針接近靶核酸序列的能力高和超微結構的良好保持。但是這種方法也有缺點，如所需設備昂貴，要有熟練的技術人員去操作，而且，切片對變性處理非常敏感，以至于會造成部分超微結構和靶核酸序列的丟失。上述三種方法的選擇取決于研究者的需要和樣本的情況，應當根據具體情況分別對待。這三種方法的優缺點已總結在表 3-1 中。以我們的經驗來看，非包埋法在敏感度和超微結構的保持上結果最好。而且，在操作過程中可以很容易地與免疫細胞化學相結合，用以在相同的切片中鑒定其他物質（如神經肽等)。我們已經利用該技術來研究軟體動物神經元中編碼神經肽的 mRNA 在軸突部分的超微結構定位。  |
|---|---|
| 實驗材料 | 組織樣品 |
| 試劑、試劑盒 | 配比溶液 |
| 儀器、耗材 | 冷凍超薄切片機 電子顯微鏡 鎳 網（75目） |
| 實驗步驟 |
一、超薄冰凍切片的組織固定
1.用干凈的玻璃器皿或者一次性器皿配制固定劑
2.用新鮮配制的固定劑
3.2%~4% 的多聚甲醛和0.2% 戊二醛固定組織。戊二醛對于確保良好的超微結構是必要的。然而由于固定劑的交聯特性，更高濃度（>0.5%) 則嚴重阻礙探針的穿透。因此，對于要用于研究的毎個樣本，必須在超微結構保持和探針穿透性之間找到平衡點。
二、固定和樣本制備
小塊組織采用浸泡固定。對于大的組織，如大鼠的腦，建議用灌注固定法。
1.過浸泡固定小塊組織，4℃ 過夜。
2.Imol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌組織 2 次，每次 10 min。
3.用含有 0.15% 甘氨酸的 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌 2 次，每次 10 min。用含 2.3mol/L 的蔗糖 PBS 液浸泡組織至少 4 h，在浸泡時持續滾動小管子。
三、標本制備
在切片前將組織塊固定在標本支持物上；我們一般用銅釘固定。
1.用砂紙將釘子表面打粗糙。
2.洗滌釘子以去除小的金屬碎片。
3.用 70% 乙醇洗滌釘子并用吸水紙干燥。
4.從蔗糖溶液中取出組織并用解剖顯微鏡將組織定位于釘子上。. 用吸水紙吸去過多蔗糖。
5.用干凈的鑷子把帶樣本的釘子放入液氮。
6.在液氮中儲存樣本直至使用
四、切片
1.把組織樣本從液氮罐轉移至超薄切片機時，應確保沒有融化。
2.超薄冰凍切片的理想溫度為 100~120℃。
3.用干刀完成切片。
4.常做一個厚切片（500nm) 用來定位組織以及檢查固定效果。這種厚切片能用 1% 甲苯胺藍溶液染色。
5.細修剪標本邊緣能改善超薄切片質量。可用剃須刀片或者玻璃刀完成。
6.對于薄切片（40~80nm)，建議使用金剛石刀。
7.用接種環把切片從刀片上分離下來。這種接種環是一個 I5 cm 的塑料把手接了一個小金屬套圈（直徑 2 mm)，金屬套圈充滿 2.3md/L 蔗糖或是蔗糖/甲基纖維素混合液。
8.用接種環收集切片后，讓它們短暫解凍，并立即轉移到篩網上。
9.用蔗糖/甲基纖維素混合液收集切片有兩個優點，一是形態結構保持得更好更完整，二是篩網在冰箱中至少能儲存 3 個月。
10.用透明塑料包被或碳包被的鎳網；銅網在處理過程中會氧化，形成骯臟的沉淀，從而干擾電鏡成像。
五、電鏡原位雜交步驟
將篩網（切片面朝下）放到含有 2% 明膠溶液的帶蓋培養皿上，在電熱板上 (37℃) 放置 5 min，然后在 37℃ 孵箱內放置 20 min。
以下步驟都在小滴液體中完成。將小滴試劑（探針和抗體溶液用 5~10ul, 洗滌用 100ul) 點在封口膜蠟上，把篩網切片面朝下放在小滴上。
該方法選用了蛋白 A-金交聯物。因為蛋白 A 與兔 IgG 的親和力高，而與羊 IgG 的親和力低，抗地高辛抗體多為山羊抗體，所以采用兔抗山羊二抗作信號放大的中介。
1.于 0.15% 甘氨酸的 PBS 溫育 2 次，每次 5 min。
2.用 2XSSC 溫育 2 次，每次 5 min。
3.在無探針的雜交緩沖液中預雜交 20 min。
4.加 O.Ig 探針液到 10ul 雜交混合液。
5.雜交篩網放入一個密閉容器中，同時放入濕濾紙以防雜交緩沖液蒸發，于 50C 置 3 h。
6.用 2XSSC 溫育 Imin。
7.用 50% 甲酰胺和 2XSSC 混合液洗滌 2 次，每次 5 min。
8.在密閉和濕化的容器中，于 50°C 用 50% 甲酰胺/2XSSC 混合液嚴格洗滌 3 次, 每次 20 min。
9.用 2XSSC 洗滌 2 次，每次 5 min。
10.用含 I%BSA 的 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min。
11.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 lOmin。
12.在山羊抗地高辛抗體（1:100 稀釋于含 1% 魚明膠的 PBS) 中室溫下溫育 Ih 或者 4C 過夜。
13.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 5 min。
14.用含有 1%BSA 的 PBS 洗滌 3 次，每次 10 min。
15.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 5 min。
16.在兔抗羊抗體（1:100 稀釋于含 1% 魚明膠的 PBS) 中溫育 30 min。
17.用含有 1% 魚明膠的 PBS 洗滌 5 min。
18.用含有 1%BSA 的 PBS 洗滌 3 次，每次 10 min。
19.在蛋白 A-膠體金交聯物（稀釋于 1%BSA 的 PBS，稀釋比例依據使用說明）中溫育 20 min。
20.PBS 洗滌 3 次，每次 15 min。
21.在含 1% 戊二醛的 PBS 中固定 10 min。
22.PBS 洗滌 5 min。
23.蒸餾水洗滌 5 次，每次 Imin。
24.在 2% 乙酸雙氧鈾液中溫育 5 min。
25.用乙酸雙氧鈾/甲基纖維素洗滌 2 次，每次 Is。
26.將切片包埋于乙酸雙氧鈾/甲基纖維素中，置冰上 10 min。
27.用接種環從甲基纖維素液體小滴上移去篩網。
28.用濾紙去除過多的甲基纖維素，將篩網留在接種環上并讓它風干 30 min。
29.轉移篩網到篩網盒中
六、免疫細胞化學
電鏡原位雜交（EM-ISH) 與免疫細胞化學組合十分方便，在上述第 22 步后，接用以下方法：
1.用含有 0.15% 甘氨酸的 PBS 洗滌 3 次，每次小于 10 min。
2.用含 1% 魚明膠和 I%BSA 的 PBS 洗滌 5 min。
3.與抗體（兔抗，稀釋于 1% 魚明膠和 1%BSA 的 PBS) 溫育 45 min。
4.用含 I%BSA 的 PBS 洗滌 5 次，每次 Imin。
5.與蛋白 A-膠體金交聯物（稀釋于 1%BSA 的 PBS) 溫育 20 min，可采用不同大小的金比較 ISH 信號的顯示。
6.下接電鏡原位雜交方法的第 20 步。
七、結果
以往的研究已經顯示，在軟體動物椎實螺，能合成卵生激素（ELH) 的神經元的軸突內含有大量編碼 ELH 的 mRNAVanMinnen1994)。我們用 EM-ISH 研究這些編碼神經肽的 mRNA 的超微結構定位。首先，我們研究了 ELH 轉錄物在合成 ELH 神經元胞體內的定位。正如所料，發現它們主要與粗面內質網膜相關（圖 3-2A)。其他細胞器中（如線粒體、高爾基體、分泌囊泡）則沒有顯示 ELH 轉錄物的存在，這一點可以從圖 3-4 中觀察到，上述細胞器并未出現 ISH 信號（小金顆粒）和 ELH 免疫反應性物質（大金顆粒）的共定位。然后，我們研究了 ELH 轉錄物在神經元軸突內的精確定位，發現它們主要位于軸漿中（圖 3-3), 在含有 ELH 的核致密囊泡中則沒有其轉錄物的存在，這一點與以前的報道相符（Dirks1996)。
在實驗中，我們主要觀察了編碼 ELHmRNA 的超微結構定位，同時也發現山羊抗地高辛抗血清能與含有 ELH
的核致密囊泡交叉反應。為了避免這一問題，我們使用了鼠抗地高辛單克隆抗體（步驟 12), 然后在第 16
步用兔抗鼠抗體來替代原來使用的兔抗羊抗體。以上數據進一步說明做 ISH 時設立正確對照實驗的必要性。
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| 注意事項 |
雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。
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| 其他 |
此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。
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