( 7 ) 關上泵，加入水飽和的丁醇以確保覆蓋住膠的頂部和下部（丁醇在分隔液的上部），放置 1 h，然后倒掉丁醇，覆蓋 Milli-Q H2O。
( 8 ) 膠最好是在室溫放置過夜，當徹底凝固時再用。拆除灌膠儀器，洗掉玻璃板上的丙烯酰胺。立刻用膠或者放冰箱暫存（最多可以保存一個星期）。
3.6 二向蛋白質分離：SDS-PAGE
( 1 ) 從托盤中取出等電聚焦膠條，用 Kimwipe 輕輕擦拭膠條的前后端以除去過多的礦物油，小心不要將 Kimwipe 觸到膠條，如果需要干膠條可以保存在 -80°C 冰箱中。
( 2 ) 將膠條放在平衡托盤中，一端稍高放置。
a. 在搖床上，用 2 ml 新鮮的還原再平衡緩沖液洗膠條 30 min。
b. 棄還原再平衡緩沖液，加 2 ml 新鮮的烷基化再平衡緩沖液。
c. 搖床搖 30 min，棄烷基化平衡緩沖液。
d. 加 2 mL SDS 電泳緩沖液，搖床搖 5 min。
( 3 ) 仔細將膠條放入預先制備好的 24 cm 的凝膠上（見 15.3.5 節） ，將膠條的塑料一端靠在玻璃板的一端，這樣使膠條容易、方便放置在凝膠上，膠條和凝膠之間不能有氣泡，用 0.5% ( m/V ) 的瓊脂糖密封液密封膠條，吸取密封液，放置在膠條上部，室溫凝固。
( 4 ) 將凝膠的膠板放入與循環的冷水系統相連的 Ettan DALTsix 電泳室里。
a. 將膠放在小槽的外部，當同時跑幾塊膠時，將它們均勻地放在兩邊，面向同一個方向。
b. 將空膠板放在池子里，直到每個槽都放滿。
c. 灌入電泳緩沖液，直到到達最大刻度線的底部。
d. 將蓋子與底部電源接通，開始電泳。
e. 如果是過夜電泳，設置電量為 2 W/gel。如果只在白天電泳，可以提高電壓，但不要超過 8 W/gel。
3.7 熒光圖像掃描
( 1 ) 打開 Typhoon 掃描儀，在使用前先預熱 30 min，預熱是為了掃描更精確。
( 2 ) 在使用前后都必須用乙醇和擦拭紙將玻璃板擦干凈。不要用紙巾擦拭，因為容易刮傷玻璃面。
( 3 ) 將玻璃板從膠槽中取出，表面擦干凈，將玻璃 cassettes 中的熒光標記凝膠按正確的方向放在玻璃板上。
( 4 ) 用合適的濾波和波長來掃描圖像，每種標記物的波長如下：Cy3 用 580BP 的濾波，532 nm 的綠色激發光；Cy5 用 670BP 的濾波，633 nm 的紅色激發光；Cy2 用 520BP 的濾波，488 nm 的藍色激發光。初始參數為 depth+ 3 mm，600 V 光電倍增管設置和 500 μm 的像素，反復進行 50~100 μm 的像素高分辨率掃描。
( 5 ) 用 Typhoon 掃描儀軟件可以獲得圖像，用數據集格式保存在包含 gel 圖像的相關文件夾中，這樣可以用 ImageQuant 打開，然后可以用數據集格式再保存，用來在 DeCyder 作進一步的處理。或者 Tiff 格式，可以使用其他圖像分析包來做進一步的處理，如 Progenesis ( Nonlinear Dynamics) 。
3.8 圖像分析
通過不同波長所獲得的圖片用 DeCyder 進行比較分析（見注釋 8) ，由于程序復雜 ，在此不作詳細介紹，基本步驟如下所述。
( 1 ) 為了確保圖像大小完全匹配，用 Process Image 測量而且進行標準化，產生一個柱狀圖，顯示兩張圖片中沒有產生變化的、增加的、減少的蛋白質點數量。
( 2 ) 使用排除過濾法，或手動刪除任何明顯的非蛋白質背景斑點或條紋。按照需要，調整柱狀圖的臨界參數顯示蛋白質點。這些蛋白質點是指定量的上調或下調表達，如大于 2 倍的差異。
( 3 ) 手動檢查柱狀圖和圖像，以確定哪些點有明顯表達變化，而且有足夠的量用于質譜鑒定。在大多數情況下，許多蛋白質盡管有顯著差異表達，但由于量很少以致于無法進行可靠的定量和可行的鑒定。最值得研究的蛋白質點通常具有中、高豐度而且差異表達非常明顯。
( 4 ) 為了更精確地定量差異表達，特別是差異性非常微弱的情況下，整個程序需要重復 3 次，這樣結果才有統計學意義（見注釋 8) 。
3.9 為了進一步處理進行再染
接下來是進行圖像分析。取走玻璃盒里的隔條，膠進行銀染 [ 29，30]。銀染要在固定的玻璃板上進行，這樣可方便觀察，并且可以手工挖取蛋白質點，以進行下一 步的質譜鑒定 [6]。相對于 CyDye 標記只能標記少部分蛋白質而言 [8] ，銀染能保證絕大多數的蛋白質都能標記上。通過銀染，用 CyDye 標記的大部分蛋白都能看見，盡管在不同的樣品之間還是有一些變化。比對銀染的圖像和 CyDye 圖像，小心確保挖到正確的點。一些小分子質量的 CyDye 通常會引起一些漂移，一些蛋白用不同方法也會引起一些差異（見注釋 9)。
3.10 結果分析：番茄根部響應鹽脅迫的蛋白質表達差異測定
1. 鹽脅迫處理
( 1 ) 在控溫溫室里，讓番茄長到 4 英寸（1 英寸= 25. 4 mm) 高。
( 2 ) 在試種時，將 20 棵幼苗在包含 MiracleGro 肥料的 Hoglan 混合肥料中生長。
( 3 ) 所有 20 棵植株每天正常澆水。20 天后，對其中的 10 株進行標記，用 25 mmol/L NaCl 處理一個星期。在此后的一個月時間里，逐漸將 NaCl 濃度提高到 100 mmol/L。
( 4 ) 10 株對照植物在整個期間都用水澆灌。
2. 葉和根組織的收集
( 1 ) 在 7 個星期期間，在連續澆灌了兩個星期的 100 mmol/L 氯化鈉之后，剪下 3~5 g 對照及處理的健康植株葉片，一個星期兩次，直到葉片壞死。
( 2 ) —旦葉片壞死，植株連根拔起，用水沖洗根部，從根的中部分成近莖端和遠莖端兩部分，立刻液氮中進行速凍。
3. 近莖端蛋白質的抽提
( 1 ) 用研錘將收集到近莖端根研碎。
( 2 ) 按 15.3.1 節提到的 TCA 丙酮方法制備蛋白質沉淀物。
( 3 ) 由于凝膠上顯示根所含的蛋白質比葉少，有必要按 15. 3. 2 節的方法抽提 3 次蛋白質，將這 3 次抽提的蛋白質放入到一個離心管中，進行 CyDye 標記 。
( 4 ) 匯集樣品，跑膠用 15. 3. 3 節、15. 3. 6 節的方法分析，結果見圖 15 -1 ~ 圖 15-4。
4. 對照及鹽脅迫的近根組織部分 DIGE 凝膠的圖像比較分析
來源于 4.3 的數據用 DIA 模型進行分析，這種模型在 15.3.8 節中已有介紹。從 DeCyder 程序輸出的起始數據用虛擬顏色代表，如圖 15-1 所示。Cy 5 標記的對照植株蛋白點為紅色，Cy3 標記的鹽脅迫植株的蛋白質點為綠色，兩種植株都有且表達量相似的蛋白點為黃色。這樣對于那些表達差異明顯的蛋白質易于識別。在這個實驗示例中，絕大多數的蛋白質點為黃色，說明這兩個樣品中蛋白表達差異不是很明顯。
兩種熒光波長掃描的不同圖像如圖 15-2 所示，這些圖像可以用來進一步分析蛋白質表達差異。這兩張圖像看起來很相似，但是圖 15-2B 上的蛋白點更多。總體蛋白質載入或者是標記效率有明顯的區別，這也是這種方法的一個顯著優點。軟件可用于標準化這兩張圖像的表達量，所有的蛋白點包含在內，只有那些表達量高于或低于平均值的蛋白質點被標示為差異蛋白點。
兩個圖像的定量分析產生的柱狀圖如圖 15-3 所示。正如蛋白質點檢測窗口所示，在標準化和處理后，軟件檢測到 421 個蛋白質點，其中有 384 個沒有變化的蛋白點， 34 個 Cy3 標記的表達量升高的蛋白點，3 個 Cy5 標記的表達量升髙的蛋白點。x 軸為這兩個圖片的蛋白質點的體積的 log 值的比率，左邊的 y 軸為蛋白質點的頻率，右邊的 y 軸為代表每個蛋白點的絕對突光強度，也就是蛋白質量。藍色曲線表示蛋白質點頻率模式柱狀圖，是基于紅色曲線的實際柱狀圖生成的。
兩條垂直的線表示蛋白質表達差異達 1.5 倍的 x 軸點和表達沒有變化的蛋白質點，顏色使用策略和圖 15-1 相似，黃色代表沒有變化的蛋白點，綠色代表 Cy3 標記表達量升高的蛋白點，紅色代表 Cy5 標記表達量升高的蛋白點。
在這種類型的分析中，許多蛋白點檢測到表達量上有變化，但是這種變化是很微弱的以至于不易鑒定。在圖 15-3 的分析中，我們運用了一個絕對熒光閾值即 106 熒光單元（如虛線所示）來排除這些蛋白質點。這里有 4 個蛋白質點，標記為 a~d，x 軸上在正常分布曲線之外，y 軸上超出了 106 熒光單元，因此這些蛋白點為 Cy3 標記的表達量超過 1.5 倍的蛋白點，這種表達量可以用來進行質譜鑒定。在柱狀圖里還有很多蛋白質表達差異顯著，但是低于我們指定的閾值。
這 4 個強調的蛋白質代表那些響應鹽脅迫并且上調表達量超過 1.5 倍的蛋白質。前 3 個蛋白點即標記為 a 、b 和 c 的蛋白點突顯了這種方法的缺點，它們是一個低分辨率蛋白質的一部分，這個蛋白質已經用分析軟件人工劃分為幾個蛋白點。然而標記為 d 的蛋白點是一個髙分辨率的蛋白點，熒光體積率為 1.79， 如圖 15-4 所示，這個蛋白點可以切下來進行質譜鑒定。