疏水相互作用層析是以介質疏水基團和蛋白質疏水區域間的親和作用為基礎的。疏水力是浸在一種極性液體（如水）中的非極性物質的排斥力。胞膜蛋白都具有一個明顯的疏水區域以錨定在膜上。可溶性蛋白質在外表面上可能存在疏水小區，它促進蛋白復合物的形成，也可能是疏水配基結合部位或活性部位。這些暴露的疏水區對疏水層析純化而言足非常理想的。盡管疏水層析利用相對非持異的親和力分離純化蛋白質，而且不具有高分辨率，但是該法很有用。
來源：《蛋白質技術手冊》
疏水相互作用介質
苯基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5
辛基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-（CH2）7-CH3
溶液鹽濃度增加時疏水作用變得更強。因此，大多數疏水層析程序都是高鹽時上樣，降低鹽濃度時洗脫。所以在硫酸銨沉淀或離子交換層析后可以方便地直接進行疏水層析純化。溫和的洗脫條件及高蛋白質結合容置（10～100 mg/ml）使疏水層析在蛋白質純化中成為很有價值的方法，也是更換緩沖液的方法之一。
蛋白質樣品液
苯基瓊脂糖 CL-4BNaCl硫酸銨磷酸鈉鹽
層析柱
下述方案設定樣品是在 75％ 硫酸銨沉淀后溶在 50％ 硫酸銨溶液的情況。
1. 裝填 5 ml 苯基瓊脂糖 CL-4B 進入柱內；
2. 10 倍柱床體積層析緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0 磷酸鈉鹽，50％ 硫酸銨）洗柱；
3. 調整樣品液符合要求，即在 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液中含 50％ 硫酸銨。上樣總蛋白量 200～500 mg；
4. 3 倍柱床體積層析緩沖液洗柱或洗至 A280 值回到基線；
5. 用分步梯度法洗脫。每步依次分別采用兩倍體積各含 40％、30％、20％、10％ 或 0％ 硫酸銨的 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液洗脫；
6. 再依次用 5 倍體積水、5 倍體積 1 mol/L NaCl 和 5 倍體積水洗柱，使其獲得再生。
