疏水層析也稱疏水作用下層析（hydrophobic interaction chromatography HIC）從分離純化生命物質的機制來看，也屬于吸附層析一類。疏水層析和反相層析（reversed phase chromatography）分離生命物質的依據是一致的，利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離。該方法基于的是蛋白質的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質會與疏水配基相結合，而其他的雜蛋白則沒有此種性質，利用此種性質，可以將蛋白質初步的分離，用于鹽析之后的蛋白質進一步提純。