病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒
一、簡介
病毒總核酸提取試劑盒適合于從血清、血漿、組織勻漿等樣品中提取病毒總核酸。試劑盒基于硅膠柱純化技術，提取過程中無需使用有毒的酚氯仿抽提，也無需進行耗時的醇類沉淀。該產品已經成功地提取了乙肝A/C、丙肝、以及諾如病毒標準品等的核酸。獲得的DNA/RNA可直接用于PCR、RT-PCR、以及LAMP等系列下游實驗。
二、組成
071091M | ||
成份 | 裝量 | |
提取次數 | 48次 | |
核酸吸附柱 | 48個 | |
2ml 收集管 Proteinase K Protease Dissolve Buffer | 48個 24 mg 2 ml | |
Carrier RNA | 250 μg | |
Buffer AL | 20 ml | |
Buffer VHB | 11 ml | |
Buffer RW2 | 20 ml | |
Nuclease Free Water | 10 ml |
注意：
1. Carrier RNA 固體使用前必須用 Nuclease Free Water 溶解至 1μg/μl，渦旋溶解。分裝保存-70℃。如需長期保存于-20℃，請先按照使用次數分裝后保存。
2. 溶解Proteinase K（20mg/ml）：加入Protease Dissolve Buffer溶解Proteinase K至終濃度為 20mg/ml。Proteinase K干粉在2-8℃保存一年，但溶解的 Proteinase K 須分裝保存于-20℃。 反復凍融 Proteinase K 會影響其活性。
3. Buffer VHB 使用前必須用14 ml無水乙醇稀釋，并于室溫保存。
4. Buffer RW2 使用前必須用80 ml無水乙醇稀釋，并于室溫保存。
三、保質期
本產品除Proteinase K和Carrier RNA外，其它組份可在室溫(15-25℃)保存12個月，長期保存時需置于2-8℃。Proteinase K 和 Carrier RNA 干粉室溫運輸，收到試產品后請保存于-20℃，溶解后分裝保存于-20℃。
四、需要準備的材料和工具
Buffer PBS
無水乙醇
潔凈的鑷子和剪刀
微量移液器（100-1000μl，10-100μl）
無RNA酶的離心管和吸頭
渦旋振蕩器
離心機（轉速≥10,000 rpm）
五、實驗步驟
轉移20 μl Proteinase K 至1.5 ml離心管中。
轉移200 μl樣品，如血清、血漿、尿液、 培養液上清、或其它無細胞體液至裝有 Proteinase K 的離心管中，振蕩混勻5秒。若樣品不足200 μl，用Buffer PBS或Nuclease Free Water 補足。
（固體組織樣品先用 Buffer PBS浸泡或勻漿后，離心取上清進行操作；干粉樣品請先用Buffer PBS充分溶解后離心取上清進行操作。）
轉移200 μl Buffer AL/Carrier RNA至樣品中，渦旋混勻15秒。
使用前，按每1 ml Buffer AL加入15 μl Carrier RNA（1 μg/μl）。該混合液室溫可保存2天。
56oC水浴10分鐘。
加入250μl 無水乙醇至裂解液中，渦旋混勻 15 秒。室溫靜置 3 分鐘。
把核酸吸附柱裝在2ml 收集管中。轉移混合液至柱子中。8,000 g離心 30-60秒。
倒棄濾液把柱子裝回收集管中。加入500 μl Buffer VHB（已用無水乙醇稀釋）至柱子中。8,000 g離心30-60秒。
使用前 Buffer VHB 必須按瓶子標簽所示用無水乙醇稀釋。
倒棄濾液把柱子裝回收集管中。加入500 μl Buffer RW2（已用無水乙醇稀釋）至柱子中。8,000 g 離心30-60秒。
使用前 Buffer RW2 必須按瓶子標簽所示用無水乙醇稀釋。
倒棄濾液把柱子裝回收集管。加入500 μl Buffer RW2（已用無水乙醇稀釋）至柱子中。8,000 g離心30-60秒。
倒棄濾液把柱子套回收集管。10,000 rpm 離心空柱3分鐘甩干柱子。
將柱子轉移至新的1.5ml離心管。加入15~30 μl Nuclease Free Water至柱子的膜中央。13,000 g離心1分鐘。
棄去柱子，把DNA/RNA 保存于-80oC。
六、常見問題解答
1. 柱子堵塞
樣品用量太多：處理動物抗凝血液時，樣品量控制在100~150 μl。盡量使用無細胞的樣品，如血漿、血清、組織勻漿液的上清等。
Proteinase K活性下降：重新制備Proteinase K。使用后Proteinase K必須保存于-20℃。Proteinase K與 Buffer AL不能預先混合。
樣品含固體顆粒：在第5步加入乙醇前，10,000 g離心3分鐘去除未消化的雜質，轉移上清液至新的離心管后再加入乙醇。
樣品裂解不充分：樣品與Buffer AL混勻不充分。重新提取，加入Buffer AL后先顛倒混勻3~5次，然后以最高速度渦旋讓樣品與Buffer AL充分混勻。
2. 下游應用結果不理想
樣品被反復解凍：避免反復凍融樣品。推薦使用新鮮樣品或只解凍過一次的樣品。
Nuclease Free Water 被污染：更換新的 Nuclease Free Water或DEPC處理水。
試劑準備有誤：按瓶子標簽所示，加入合適體積的無水乙醇至 Buffer VHB 和Buffer RW2 中。
Proteinase K活性下降：重新制備Proteinase K。使用后Proteinase K 必須立即保存于-20℃。分裝保存 Proteinase K，避免反復凍融。
乙醇殘留：柱子在洗脫前，需要空甩去除乙醇。對于敏感的應用，柱子在洗脫后，打開柱子的蓋子，放置 10~15 分鐘讓乙醇徹底揮發。
洗脫效率：處理富含 DNA 的樣品時，把 Nuclease Free Water預熱至55℃后再進行洗脫，有利于提高DNA得率。