病理制片技術——冷凍切片的制作

一、概述

冷凍切片是利用物理降溫的方法將新鮮的組織標本冷凍使其產生一定的硬度進行切片的技術方法。與石蠟切片相比，由于冷凍切片不需脫水包埋因此制片速度 快，是為手術進行中的臨床醫師提供病理診斷的良好方法。此外由于冷凍切片的標本是未經固定的新鮮組織，因此冷凍切片也是脂肪染色、酶組織化學染色以及某些 免疫組織化學染色和原位分子雜交的理想制片方法。冷凍切片的不足是組織細胞的形態略遜于石蠟切片。

二、冷凍切片的制作方法

利用氯乙烷噴灑、二氧化碳噴射、半導體制冷的方法均可制作普通的冷凍切片，用于術中的病理診斷。恒冷箱冷凍切片機可以制作適用于各種目地的冷凍切片，是目前最為常用的理想冷凍切片制片方式。

1.冷凍切片的技術操作方法
(1)將恒冷箱冷凍切片機的速凍頭和箱內溫度調整到適宜的切溫度，一般情況下為一18～一25℃。
(2)在標本冷凍托上涂布一層冷凍包埋劑一OCT，然后將取材后新鮮標本安放在標本冷凍托上并用OCT覆蓋標本。
(3)標本冷凍完成后將標本托固定在切片機的機頭上，調整機頭位置使其恰好位于切片刀的后方。
(4)使用粗切削方式進行標本的粗切削至暴露標本的最大平面，使用自動推進方式連續切削2～3刀后用毛筆清除機頭、標本托及切片刀上的組織碎屑。
(5)調整并確認切片的厚度，一般為4～8 um，染脂肪和神經組織應控制在12~25 um。
(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好與切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。
(7)以自動推進的方式進行切片，良好的切片將在防卷板的下方形成一張完整平整的薄片，如切片略有彎曲可用小毛筆輕輕展平切片。
(8)打開防卷板，用載玻片平穩地輕壓切片使其平整地吸附到載玻片上。

三、冷凍切片的染色

切好的冷凍切片立即投入丙酮中進行固定，一般固定1～2 min即可進行染色，用于免疫組化染色的冷凍切片應在切片略干時即刻投入冷甲醇中固定10~15 rmin然后進行相應的組織化學染色程序。

1．冷凍切片的HE染色程序。
(1)切片在丙酮中固定1～2 min。
(2)水洗5 s。
(3)使用新鮮的Harris蘇木精染液染細胞核2min。
(4)水洗5 s。
(5)在0.5％的鹽酸乙醇液中分化1～3 s。
(6)水洗5 s。
(7)在0.5％～1％的伊紅染液中染細胞質20~30 s。
(8)水洗5 s。
(9)在95％乙醇I、95％乙醇Ⅱ、100％乙醇I、100％乙醇Ⅱ、中逐級脫水各3～5 s。
(10)甲苯I、二甲苯Ⅱ透明各5 s。
(11)干組織周圍的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光學樹脂膠封片。

四、注意事項

1．提倡使用新鮮蘇木精染色液：高質量的冷凍切片和良好的染色，是病理醫師為在手術中的外科醫師提供病理診斷的重要手段。為了在短時間內獲得高質量的HE染色冷凍切片，在保證高質量冷凍切片的同時使用新鮮的蘇木精染色液是保證高質量染色的重要前提。

2.防卷板的調整：正確地調整使用冷凍切片機的防卷曲板是獲得平展完整冷凍切片的重要手段，防卷曲板的正確位置是與切片刀
的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板過度突出于刀刃會造成切片機頭上的組織與防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃會造成切片向上卷曲不能形成平整的切 片。在調試時可從下向上逐步提高防卷曲板的位置，每提高一點切一張切片測試，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。

正確位置 　　　 防卷曲板低于刀刃 　 防卷曲板過于突出

3.防止污染：切片污染是病理組織制片的大忌，在冷凍切片進行粗切削完畢后必須用毛筆清理碎屑，以防止其他標本的組織碎片沾染到正在進行切片的標本上。

4．不同組織的切片溫度調整：不同組織冷凍切片的冷凍溫度調整原則是，柔軟稚嫩富含水分的組織選擇相對較高的溫度，較為致密富含脂肪的組織選擇相對較低的 溫度。柔軟稚嫩富含水分的組織選擇較低的溫度易造成切片呈碎屑狀，而致密富含脂肪的組織選擇較高的溫度易造成切片堆積不能形成片狀。詳見表9·1。

表9．1 部分組織冷凍切片的