本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體 T7 RNA 聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶啟動子（PT7）的控制下。應用脂質體轉染，重組質粒進入感染了 vTF7-3 的細胞質中，而 vTF7-3 是一種能編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒（見「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）。在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶轉錄。這種轉染方案適用于分析的目的，因為不需要構建新的重組病毒，所以比較簡單。
對于大規模的工作，PT7 操縱的基因可以通過同源重組插入另一個重組痘苗病毒中，使之與 vTF7-3 共同感染懸浮細胞（見「兩種重組痘苗病毒共感染細胞」）表達的蛋白質可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法分析鑒定，用「離子交換層析實驗」描述的方法純化。
重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染
| 實驗方法原理 | 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質粒載體開始，然后用重組質粒通過脂質體介導轉染已經被vTF7-3（可以持續表達T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的細胞。收獲后，基因產物在細胞內的表達可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法分析鑒定。 |
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| 實驗材料 | 脂質體懸液vTF7-3 痘苗病毒儲液生長至匯片的 CV-1 細胞重組質粒 |
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| 試劑、試劑盒 | 低血清 Opti-MEMI 培養基完全 DMEM-10 培養基 |
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| 儀器、耗材 | 6 孔組織培養板杯狀超聲儀聚苯乙烯管 |
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| 實驗步驟 | 1. 用 CsCl/溴化乙錠離心或 PEG 沉淀純化重組質粒，每孔細胞需要 5 μg DNA 進行轉染。
如果使用 pTM1 質粒（圖 16.16.2）, 必須保證目的基因起始 ATG 位于 pTM1 的 NcoI 位點。可以通過限制酶作圖或 DNA 測序鑒定構建是否正確。
2. 在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培養基將 5×105 CV-1 細胞/孔加入 6 孔組織培養板培養。直至細胞幾乎匯片生長（一般過夜）。用血球計數器對細胞進行計數。
3. 將 vTF7-3 儲液渦旋混勻以打散團狀物。按照下面的步驟用杯狀超聲儀進行超聲：
3.1 在杯中裝入冰水（大約 50％ 的冰）；
3.2 將裝有 vTF7-3 儲液的小管放在冰水上；
3.3 以最大功率超聲 30 s，儲液置冰水上 >30 s，再繼續超聲。
4. 用 Opti-MEMI 將病毒稀釋至 2×107 pfu/ml。
5. 用 0.5 ml/孔的稀釋病毒儲液（10 pfu/細胞）感染步驟 2 制備的 CV-1 細胞。溫育 30 min，每 5～10 min 晃動一次。
6. 在感染結束前 5 min 制備脂質體懸液。加入 1 ml 的 Opti-MEMI 至 12 mm× 75 mm 聚苯乙烯管中（每孔制備一管），渦旋脂質體懸液，加 15 μl 至培養基中，渦旋混勻。加入 5 μg 的重組質粒（來自步驟 1），輕輕混合均勻。
脂質體在儲存期間會沉淀，因此在使用前，應將其渦旋混勻。不要使用聚丙烯管，因為 DNA/脂質體混合物會吸附在其表面。
7. 吸出 CV-1 細胞的病毒接種物，直接加入 DNA/脂質體混合物。培養 5～24 h，表達的蛋白質可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法鑒定。
收起 |
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| 注意事項 | 1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。
2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。 |
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| 其他 | 重組質粒：將目的基因亞克隆到 pTF7-5 或 pTM1 載體或其他含有 T7 啟動子的質粒。 |
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