痘苗病毒DNA提取實驗

純化的痘苗病毒

Tris?Cl 溶液 SDS 蔗糖溶液 蛋白酶 K 用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚 1：1苯酚氯仿 1 mol／L 乙酸鈉 乙醇

分光光度計 Sorvall 離心機

1. 在 260 nm 處確定純化的疸苗病毒的光密度，將 20 個光密度單位的病毒（見「痘苗病毒純化實驗」 步驟 24）加入到 50 mmol/L pH 7.8 的 Tris ? Cl 緩沖液中，終體積為 1.2 ml。

2. 將以下溶液加到病毒懸液中（終體積為 2 ml）：

0. 1 ml 1 mol/L pH 7.8 的 Tris ? Cl

0.1 ml 10％ SDS

0.2 ml 60％ 蔗糖溶液

0.4 ml 10 mg/ml 蛋白酶 K

37℃ 溫育 4 h。

3. 用苯酚抽提 2 次，每次加入等體積的平衡苯酚，搖動離心管輕輕混勻，室溫，300 g 離心 10 min，用去掉頭部的槍頭將上層水相吸出保留。

4. 用步驟 3 所述的方法，再用 1:1 的苯酚氯仿抽提 1 次。

5. 加入 1/10 體積的 1 mol/L pH 7.0 的乙酸鈉和 2.5 體積的 100％ 乙醇。輕輕混勻，并在 -20℃ 冷凍幾個小時。

6. 以最大的速度 4℃ 微量離心 10 min，吸棄上清。

7. 用 95％ 乙醇清洗沉淀 2 次，每次加入乙醇后以最大速度微量離心，吸出上清。空氣干燥后用 100 μl 的水溶解。

8. 制備稀釋液（僅取一小部分），用 A₂₆₀ 測定 DNA 濃度。

在本操作中不要渦旋 DNA。因為痘苗病毒的基因組很大，如果想得到完整長度的 DNA（如用于限制酶切分析）就必須小心操作，以免剪切 DNA。