| 實驗方法原理 | 以前，用 HindIII 限制性內切核酸酶消化鑒定痕苗病毒 DNA。大部分的外源基因插入重組病毒的 TK 基因中，TK 基因位于 HindIII 5.1 kb 的 J 片段上。這樣在重組病毒中，如果插入片段上沒有 HindIII 內切酶位點，則J片段就會增大。如果缺乏 HindIII 5.1 kb 的J片段，說明沒有污染野生型痘苗病毒。Southern 雜交可以分析提純病毒的 DNA，也可分析感染細胞的初級裂解物。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 完全 MEM-5 和 MEM-10 培養基PBS胰酶低鹽緩沖液蛋白酶K平衡的苯酚1:1 苯酚氯仿TE 緩沖液乙酸鈉乙醇HindIII 限制性內切核酸酶和相應緩沖液 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 用生長至匯片的單層 BS-C-1 細胞建立用于病毒感染的細胞培養液（見基本方案 1 步驟 1~5）。 2. 用完全 MEM-10 培養基將 2.5 × 105 細胞/孔放入 12 孔組織培養板培養（每孔終體積為 1 ml），細胞匯片生長（應小于 24 h）。 3. 在使用前，將一定體積的痘苗病毒儲液與 0.25 mg/ml 胰酶混合，渦旋混勻。在 37℃ 水浴鍋中保溫 30 min，并在保溫過程中每隔 5~10 min 渦旋混勻一次。 病毒儲液的滴度常常在 2 × 109 pfu/ml 左右，但根據其來源的不同病毒滴度也可能低一些。 如果經過渦旋混勻后，還可以看見團狀物，將其冷卻到 0℃ 并在冰上超聲波作用 30 s。可以重復幾次超聲，但超聲的間隔中應當使樣品在冰上冷卻。 4. 吸出培養基，加入 250 μl MOI 為 10~20 pfu/細胞的完全 MEM-5 培養基，培養 2 h， 每隔 30 min 輕輕搖動培養板，使細胞均勻接觸病毒。 5. 加入 1 ml 完全 MEM-5 培養基，培養大約 24 h。 6. 刮下細胞，轉移到微量離心管中，最大轉速室溫離心 30 s，棄培養基。 7. 將沉淀用 50 μl PBS 重懸，渦旋混勻。 8. 在微量離心管中加入 300 μl 低鹽緩沖液和 10 μl 的 20 mg/ml 蛋白酶 K，再加入細胞懸液，渦旋混勻， 37℃ 放置 5 h 到過夜。 9. 用等體積苯酚抽提 1 次，再用 1:1 的苯酚/氯仿抽提 1 次。 如果苯酚抽提后，溶液比較黏稠，將其過 25-G 的針頭，以剪切 DNA 降低黏稠度。 10. 加入 1/10 體積的 pH 6.0 的 3 mol/L 乙酸鈉（終濃度為 0.3 mol/L）和 2.5 倍體積 95% 的乙醇。于冰上放置 30 min 或 -20℃ 放置過夜。 11. 4℃ 以最大轉速離心 10 min，棄上清。 12. 用冰浴的 70% 乙醇洗滌，空氣中晾干。 13. 用 100 μl pH 7.8 的 TE 緩沖液溶解沉淀。 14. HindIII 限制酶消化 15 μl DNA 溶液，Southern 印跡及雜交分析鑒定。 |
| 注意事項 | 1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。 2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須是無菌操作。 |