癌癥為什么發生在特定細胞里？單一細胞測序可以解答！

　　 我們都知道癌癥的起源離不開細胞突變，我們體內很多細胞的突變都可能會引起癌癥，但相應的是，也有很多突變并不會導致癌癥的發生，而如何辨別這些突變會不會引起癌癥便是一個癌癥早期防治的關鍵問題，在最新發表的一篇研究報告中，研究人員們探究了視網膜母細胞瘤與特定細胞突變的關系。

Frolov 與 Ariss以及單一細胞測序儀

　　該研究結果發表于 2018 年 11 月 27 日的 Nature Communications,由來自美國伊利諾伊大學芝加哥醫學院的生物化學和分子遺傳學教授 Maxim Frolov 的團隊完成。

　　研究背景

　　視網膜母細胞瘤蛋白（pRB）的功能失活通常被認為是該處癌癥發生發展過程中一個必不可少的事件，研究者通常認為這種聯系是因為它通過夫調控 E2F 轉錄因子阻斷細胞周期進程的能力導致。當 E2F 與 pRB 結合后，它自身的轉錄活性會被抑制并終止細胞周期同時，pRB 則會釋放 E2F 并允許 S-phase 進入——這些簡單的觀點建立在一個假設之上：即 pRB 在不同單元類型之間以相同的方式運行。

　　然而小鼠模型和臨床研究的結果表明，pRB 的功能受細胞環境的影響很大，pRB 失活的后果被認為是由圍繞 pRB 一種獨特的細胞類型特異性分子電路決定，這種特定的相互作用也有助于解釋為什么癌癥會起源于特定的細胞類型。

　　例如，人類視網膜母細胞瘤被認為起源于有絲分裂后錐細胞的前體，這些細胞對 Rb 損失表達錐血統因素（TRβ2 and RXRγ）和癌蛋白基因 MYCN、MDM22 格外敏感。因此，了解 Rb 通路中的突變如何影響各類型細胞也就顯得格外重要。

　　研究手段

Ariss 制作的單一細胞 RNA 測序儀

　　在最近的發展中，單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）的研究進展位檢測細胞水平的變異和將異質組織解剖成獨特的細胞團提供了新的可能，在過去的研究中，研究者很難只收集一種細胞類型的純樣品，科學家不得不使用從整個組織中提取的大量樣本——使用這些樣本檢測 RB 突變影響的結果并不能準確地代表 Rb 突變如何影響特定類型的基因表達。

　　然而有了 scRNA-Seq 技術，研究者們可以研究單個細胞中的基因表達，從而消除細胞樣本受污染的問題。 Frolov的實驗室采取了一種名為 Drop-seq 的測序技術，可以同時對數千個細胞進行單獨的測序并排序。

　　而在模型生物的選擇上，研究者們選擇了果蠅，因為它們具有哺乳動物 RB 通路的流線型版本，Rbf 在果蠅幼蟲眼成像盤中的失活導致細胞周期的缺陷和凋亡——這些都與哺乳動物一致。

　　Rbf 突變的眼盤是應用 scRNA-seq 方法以及研究會使 Rbf 突變細胞對凋亡敏感的那種特定細胞環境的理想設置。

　　研究概述

　　Frolov的研究團隊研究了 11500 個野生型果蠅的眼盤細胞并制作了圖譜。

　　研究者首先利用 Drop-seq 在第三齡幼蟲眼盤構建細胞目錄，在其視柄和視觸角區解剖，分離成單細胞懸浮液，在 11 個生物復制過程中解剖 550 個眼盤并執行 scRNA-seq，在質量控制后，從 11416 個單個細胞中收集測序數據，共檢測到 16331 個基因，隨后使用 Seurat8 進行了 tSNE 分析確定了 15 個不同的細胞群，使得樣品間沒有明顯的批量效應。

　　之后研究者們使用 scRNA-seq 鑒定了一個 Rbf 突變特異性細胞簇，他們對 Rbf120a 突變體眼盤進行了 3 次復制，得到 5203 個 Rbf 突變細胞的 scRNA-seq 數據集，然后選取了 5591 個野生型細胞，將這兩份數據集進行 tSNE 分析并比對，得到結果如下。

　　結果表明選取標志物的變化傾向與之前觀察到的結果一致，另一方面研究者發現，Rbf 突變會導致糖酵解基金表達上調，致使糖酵解活性增加而降低細胞內的 PH 值，而細胞內的酸化會增加 Rbf120a 細胞的凋亡。

　　Frolov的實驗也證明了 scRNA-seq 在對細胞改變方面的價值，如果使用 RNA-seq 之類的傳統方法，無法檢測到這些突變。

　　同時，這些實驗結果也在強調高分辨率野生型細胞圖譜在繪制突變體 scRNA-seq 數據集中的價值，不止 Frolov注意到 scRNA-seq 在樣本間具有顯著的可重復性。

　　研究者的話

　　“這是首次在果蠅眼睛細胞中進行單一細胞 RNA 測序，我們必須創建一個全面的圖譜來準確描述正常眼睛中每種細胞類型的基因表達，之后再依靠這個圖譜來確定 RB 突變如何影響眼睛中每種細胞類型的基因表達。” Frolov說道，“我們在 RB 突變細胞的觀察中，發現那些代謝的改變使它們變得脆弱，而在治療時我們可以利用這些這種脆弱，在其他突變來襲時使它們對細胞死亡具有抵抗力，這些影響僅限于如此小的一組細胞，所以之前在分析中通常都會被忽略。”

　　為了搭建研究中重要的 Drop-seq 平臺，論文第一作者 Ariss 耗費了三個多月的時間，他們是伊利諾伊大學芝加哥醫學院第一批做單一細胞測序的人，因此也得不到更多的指導。

　　Ariss 表示：“這是一項真正革命性的技術，有望揭示癌癥的起源，以及為什么會從某種細胞發源而不是別的類型，在過去的一年半里，我們進行了一百多個實驗，從果蠅器官、小鼠腫瘤以及人類細胞系中產生了超過 10 萬個細胞的轉錄組，我們希望更多的研究者未來也可以使用它。”

　　參考文獻：

　　1、Majd M. Ariss et al, Single cell RNA-sequencing identifies a metabolic aspect of apoptosis in Rbf mutant, Nature Communications (2018).

　　2、Dick, F. A., Goodrich, D. W., Sage, J. & Dyson, N. J. Non-canonical functions of the RB protein in cancer. Nat. Rev. Cancer 18, 442–451 (2018).

　　3、Xu, X. L. et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature 514, 385–388 (2014).

　　4、Moon, N.-S., Di Stefano, L. & Dyson, N. A gradient of epidermal growth factor receptor signaling determines the sensitivity of rbf1 mutant cells to E2F-dependent apoptosis. Mol Cell. Biol. 26, 7601–7615 (2006).

　　5、Macosko, E. Z. et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell 161, 1202–1214 (2015).