生化反應弱，一般不發酵糖類，但分解蔗糖和乳糖，產酸不產氣，不產生H2S和吲哚，過氧化氫酶試驗陽性。
本菌常發生光滑型到粗糙的相變異：Ⅰ相為光滑型，菌落光滑，有莢膜，毒力強；Ⅳ相為粗糙型，菌落粗糙，無莢膜，無毒力。Ⅱ、Ⅲ相為過渡相。一般在疾病急性期分離的細菌為Ⅰ相，疾病晚期和多次傳代培養可出現Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ相的變異。發生這種變異時，細菌形態、菌落、溶血性、抗原結構和致病力等均出現變異。
百日咳桿菌含有耐熱的菌體（O）抗原和不耐熱的莢膜（K）抗原。前者為鮑特氏菌屬共同抗原，后者僅存于百日咳桿菌。
本菌抵抗力弱。56℃30分鐘、日光照射1小時可致死亡。對多粘菌素、氯霉素、紅霉素、氨芐青霉素等敏感，對青霉素不敏感。